[发明专利]超支化聚氨基酸及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及非病毒基因载体，具体是涉及化学组成为超支化聚氨基酸的非病毒基因载体及其制备方法和应用。

背景技术

基因治疗是通过合适的载体将目的基因传递到患者体内特定组织细胞(靶细胞)内进行适当的表达，以纠正或改善该致病基因所产生的缺陷，达到治疗疾病的目的。基因治疗在半个世纪的发展道路上取得了很大进展，也遇到了很多困难。目前，基因治疗要进入实用阶段，还有一些根本问题需要解决。其中，安全、高效的基因载体的构建是最重要的问题之一。一般来说，基因传递系统分为两类，病毒载体系统和非病毒载体系统。非病毒载体主要依靠带正电的聚合物或带正电的脂质体与DNA结合形成一定大小的复合物进行输送。但由于脂质体DNA复合物的结构非常复杂，在体内的复杂环境中转染效率不稳定，因而在实际应用中成功的例子并不多。研究中发现一些阳离子聚合物能与DNA形成纳米级的复合物并帮助DNA转染，如聚赖氨酸(PLL)，聚乙烯亚胺(PEI)，PAMAM树形分子，鱼精蛋白等。这些阳离子聚合物都已经在体外基因传递中广泛应用。其中，树形高分子具有结构规整的特点，分子外围分布着很多可质子化的氨基，使其能够与DNA进行有效的结合。但是制备步骤复杂及制备成本高使树形高分子的应用受到限制。而超支化的聚合物则可通过一步反应由低分子量的原料得到大量产物，其合成步骤相对于树形高分子简单得多。

人们在对源于HIV-1病毒的转录反式激活因子(Tat)蛋白的研究中发现，Tat蛋白之所以能自发地穿越细胞膜是因为其含有由10到16个氨基酸组成的特定序列的肽链，这类肽链被称为细胞穿越肽(cell-penetrating peptide，CPP)。CPP主要由精氨酸，赖氨酸等碱性氨基酸组成，其中精氨酸的作用尤为重要。近年来，很多研究机构开始关注CPP对细胞膜的穿越性能，而且研究表明，很多含精氨酸多的多肽显示了很强的细胞穿透能力。一般认为，精氨酸的带正电的胍基侧基与细胞之间除了静电作用之外，由于具有三角形的几何结构，还能与细胞膜上磷酸酯基形成较强的氢键，从而促进对细胞膜的穿越。

本发明以天然氨基酸为原料，通过简单的热缩聚的方法制备出具有类似细胞穿透肽以及在内体中有高缓冲能力的超支化阳离子聚合物，以得到高效低毒的基因载体。

发明内容

本发明目的是提供一种工艺简单、成本低廉的超支化聚氨基酸及其制备方法和应用。

本发明目的是提供作为基因载体的超支化聚氨基酸。

本发明提供的超支化聚氨基酸非病毒基因载体，其化学组成具有以下通式：

式中Lys、Arg、His分别为赖氨酸、精氨酸、组氨酸，X为除上述氨基酸之外的任何一种或几种氨基酸，a，b，c，d分别为赖氨酸，精氨酸，组氨酸及其他任何一种或多种氨基酸在该聚合物中的摩尔分数(a+b+c+d＝1，0.2≤a≤0.95、0≤b≤0.8、0≤c≤0.8、0≤d≤0.3)。

本发明提供的超支化聚氨基酸非病毒基因载体的制备方法，包括如下步骤：将赖氨酸或赖氨酸盐与上述超支化聚氨基酸的化学组成中含有的其它氨基酸或其氨基酸盐混合均匀后，在130～180℃加热反应混合物进行热缩聚，在该温度下反应2～64小时后得到超支化聚氨基酸；赖氨酸或赖氨酸盐与所述的超支化聚氨基酸的化学组成中含有的任一种其它氨基酸或其氨基酸盐的摩尔比为1∶0～20，其中的1∶0表示所述的超支化聚氨基酸的化学组成中的b、c或d为0时对应的氨基酸或其氨基酸盐原料用量为0。

本发明提供的超支化聚氨基酸，其特征在于在分子量Mw为1.0×10³g/mol～1.0×10⁵g/mol的范围内具有较好的转导效率。

本发明提供的超支化聚氨基酸与外源基因结合作为基因载体的应用：

超支化聚氨基酸作为基因载体，通过合适的转导方法，可把目的基因带入人体细胞和各种动植物细胞，用于人体基因治疗和动植物的基因转导。

(1)超支化聚氨基酸基因载体的人体及动物细胞基因转导：把超支化聚氨基酸与外源基因(DNA或RNA)结合所形成的复合物与人体及动物细胞共培养，复合物可以转导入细胞。结果表明超支化聚氨基酸能有效转导基因，并能在细胞中高效表达。

(2)超支化聚氨基酸基因载体的植物细胞转导：把超支化聚氨基酸与外源基因结合所形成的复合物与植物细胞进行共同培养，超支化聚氨基酸能有效转导植物细胞并实现基因的表达。

本发明的技术效果：