[发明专利]一种可用于艾滋病基因治疗的多靶点siRNA重组慢病毒载体

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学、病毒学和基因治疗领域，更具体地涉及可用于艾滋病基因治疗的多靶点siRNA重组慢病毒载体的构建。 

背景技术

由艾滋病毒(HIV)感染引起的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是全世界面临的主要健康威胁之一。据2008年11月30日发布的我国卫生部、联合国艾滋规划署和世界卫生组织联合对我国艾滋病疫的评估显示：截至2007年底，中国现存的艾滋病病毒感染者和病人约70万人，其中艾滋病病人8.5万，全人群感染率为0.05％。艾滋病疫情严峻，而目前仍然没用有效的疫苗。尽管目前治疗艾滋病的药物(如“鸡尾酒”疗法HAART)能有效地延长患者生存时间，但因长期用药引起的抗药性及严重的副反应使得该疗法难以继续进行。因此，艾滋病新的治疗方法亟待研发，而基于RNA干扰的基因治疗技术给了我们新的希望。 

RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象是生物界近十年以来最令人兴奋的发现之一。它是一种序列特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional genesilencing，PTGS)的过程。目前，RNAi机制已基本阐明：内源或外源的dsRNA(双链RNA)在细胞质中被Dicer切割成带2个碱基突出的3’末端的21～23nt的小干扰RNA(siRNA)，后者与RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex，RISC)结合。siRNA在RISC中被解链，其中反义链引导RISC靶向与之互补的mRNA，RISC则在互补序列中间切割mRNA，从而抑制靶基因的表达。 

目前，RNAi技术已广泛应用于抗病毒及肿瘤等疾病防治研究领域。在艾滋病防治方面，一个显然易见的策略就是用siRNA靶向病毒基因。事实上，艾滋研究者们已经设计出了siRNA靶向HIV-1的编码序列以及非编码序列(nef，tat，gag，vif，env，rev，LTR)(Boden et al.，2004；Capodici et al.，2002；Novina et al.，2002；Han et al.，2004；Jacque et al.，2002；Lee et al.，2002；Novina et al.，2002)。然而，这种干扰方法只是在短期有效。由于HIV突变率高，能改变病毒RNA二级结构，能编码RNAi阻遏物，以上能力使之能逃选RNAi的抑制作用，这使得RNAi在长期 抑制HIV复制方面变得困难(Das et al.，2004；Westerhout et al.，2005)。为解决这一难题，我们可以设计出针对某一个病毒基因不同区域的多种siRNA，用这复合的siRNA去干扰病毒基因，可以有效延缓病毒逃逸的出现，这是因为病毒不可能同时改变多个序列而仍然保持其复制能力(Brake et al.，2008)。另一种防止病毒逃逸的策略是用siRNA干扰病毒完成其复制所必须的相关宿主蛋白，而干扰该蛋白不应影响细胞正常功能。目前，符合这一要求的最理想的宿主靶点是作为HIV辅助受体之一的CCR5。有证据表明，CCR5对人体的正常生长、分化及免疫功能并不是必需的。在欧美大约1％的人群天然缺失CCR5蛋白，而以上人群对HIV有着显著的防御力。 

基于以上背景，本发明选择了设计多种siRNA同时干扰HIV保守基因及宿主蛋白CCR5的策略，构建siRNA重组慢病毒载体，以获得干扰的叠加效应、长效抑制以及延缓病毒逃逸的效果。基于慢病毒载体的艾滋病基因治疗的研究，在国际上已有研究进入了临床I/II期阶段，其中一命名为“OZ1”的艾滋病基因治疗试验在临床II期取得了较大成功(Mitsuyasu et al.，2009)。这项研究表明艾滋病基因治疗是取代药物治疗的可行方式，患者可能无需依赖于长期的药物治疗。基因治代表了一种新的、具有潜力的、长期有效的疾病控制方式，无疑为艾滋病治疗开辟了新的途径。与此相比，国内在此研究领域差距甚远，这一方面说明，基因治疗在艾滋病治疗领域的应用是一个明显的趋势；另一方面也显示了在国内填补这一领域的空白的必要性和紧迫性。本发明正是为填补这一空白，为后续研究提供基础，在我国艾滋病基因治疗领域将可能发挥重要作用。 

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种可用于艾滋病基因治疗的多靶点siRNA重组慢病毒载体，该载体相比于单靶点siRNA重组慢病毒载体具有更高效率的抑制艾滋病毒复制的能力，能克服或延缓病毒逃逸，且适合于艾滋病基因治疗。