[发明专利]安哥拉糖胺糖基合成酶及糖基转移酶多基因共表达系统的构建及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及的是抗生素稀有糖基合成和转移以及抗生素结构修饰(糖基化)相关的多基因共表达系统，特别是一种含有安哥拉糖胺合成酶和糖基转移酶基因的共表达质粒的构建和表达工程菌的应用。

背景技术：

抗生素等许多天然活性物质结构中都含有糖基，这些糖基连接在抗生素分子母核特定位置上，对化合物发挥生物学活性至关重要，甚至是必需功能团。糖基结构、糖基数量以及在糖基受体上的连接位置和连接方式的差别都会对抗生素的生物学活性产生很大影响。抗生素的糖基结构呈现多样性，相应的糖基转移酶也呈现低底物识别特异性，因此利用糖基化修饰从遗传水平上对现有抗生素进行结构改造是当今抗生素研发中一个重要研究领域【代焕琴，王浩鑫，沈月毛，抗生素糖基转移酶研究进展，中国抗生素杂志，2007，5(32)：257-262；尚珂，胡又佳，朱春宝，朱宝泉，脱氧糖组合生物合成的研究进展，中国医药工业杂志，2007，38(4)304-308】

因为抗生素天然结构中含有的脱氧糖基的体外化学合成往往比较复杂，收率很低。这些脱氧糖基来源的问题在很大程度上限制了在体外对抗生素实现脱氧糖基的修饰，所以利用体外糖基化实验对抗生素进行糖基化修饰研究的例子不是很多。

安哥拉糖胺(angolosamine)是一种稀有的脱氧己糖胺，仅在有限几种链霉菌的次生代谢产物结构中发现，目前也没有商品化，其化学合成需要十几步，收率很低【Fraser-reid B，Kelly DR，Tulshian DB.And Prasad SR，Routes From“Triacetyl Glucal”to 6-Deoxy-Hex-2-Enopyranosides，J Carbohydrate Chemistry，1983，2(2)：105-114】，这就限制了在体外利用这种糖基对抗生素进行安哥拉糖基化修饰的研究。但这个安哥拉糖胺的生物合成酶基因和相应的糖基转移酶基因都已经克隆和测序，可以利用这些基因资源进行体内的糖基化修饰的研究和药物结构的改造。所以本发明旨在把链霉菌来源的安哥拉糖胺合成酶基因和糖基转移酶基因共表达在一个质粒上，在细菌体内实现对聚酮抗生素的安哥拉糖胺修饰(糖基化)。

发明内容：

本发明目的是利用现有基因资源构建安哥拉糖胺(angolosamine)生物合成酶及糖基转移酶多基因共表达系统，通过生物转化(bioconversion)，在细胞体内对不含糖基的聚酮抗生素实现安哥拉糖胺修饰。

本发明是这样实现的：利用现有基因资源，通过基因工程手段，以含安哥拉糖胺合成酶和转移酶基因的链霉菌基因组文库质粒为模板，进行PCR扩增，得到6个糖基合成酶基因(med-ORF20，18，17，16，15和14)和一个糖基转移酶基因(med-ORF8)(这7个基因序列已经测序和发表，在GenBank中它们的蛋白序列号分别为BAC79028，BAC79029，BAC79030，BAC79031，BAC79032，BAC79033，BAC79040)。将经测序正确的7个基因依次连接并插入到过渡载体pNEB193J的高效启动子P_actIII-actI下游，然后从得到的质粒上切下9kb的表达盒片段(包含7个基因及上游启动区域)，插入到链霉菌质粒pSET152上，获得一个链霉菌多基因共表达质粒pAYT55。然后通过原生质体转化，将pAYT55导入常用的链霉菌表达细胞CH999中，构建多基因共表达系统工程菌CH999/pAYT55；或者通过原生质体转化，将pAYT55导入链霉菌细胞且能产生芳香聚酮抗生素Kalafungin的菌株B135中，构建多基因共表达系统工程菌B135/pAYT55。通过生物转化，在细胞体内对不含糖基的聚酮抗生素实现安哥拉糖胺修饰。

具体步骤为：

1)安哥拉糖胺糖基合成酶及糖基转移酶基因的扩增和测序。

安哥拉糖胺糖基合成酶及糖基转移酶多基因共表达系统的构建是通过PCR方法，以含有安哥拉糖胺合成酶和转移酶基因的链霉菌基因组文库质粒为模板，将6个安哥拉糖胺合成酶基因(med-ORF20，18，17，16，15，14)以及一个稀有的C-糖基转移酶基因(med-ORF8)分别进行扩增克隆，利用常规方法合成引物，应用常规方法进行PCR，在常规PCR条件下，进行扩增，分别扩增0.2-4.2kb 5个DNA片段，分别克隆到pT7Blue载体上，送公司测序。

2)安哥拉糖胺糖基合成酶及糖基转移酶多基因共表达质粒的构建。