[发明专利]一种抗人组织激肽释放酶单克隆抗体及其制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗人组织激肽释放酶的单克隆抗体及其制备方法，属于免疫化学技术领域。 

背景技术

人组织激肽释放酶是一个大的多基因家族，由15个成员成。人和动物组织激肽释放酶中只有一种酶能有效地使激肽原释放生物活性物激肽。在人体内该酶称为胰/肾激肽释放酶，新的统一命名KLK1编码hk1蛋白。hk1能水解低分子量激肽原使之生成激肽，而激肽与血管平滑肌细胞膜上的舒缓激肽B2受体结合后，可使血管平滑肌NO增多，进而通过cGMP第二信使途径舒张血管，达到降压的目的。遗传高血压及自发性高血压病人都可见激肽释放酶含量下降。近年来的研究结果表明，hK1除具有降血压作用外，对肾脏损伤的修复也具有明显的治疗作用，还可降低胶原密度、心肌细胞体积和左心室内径，并能增大毛细血管密度，从而有利于心脏重塑。因此，hK1的在心血管疾病诊断和治疗方面具有广阔的应用前景。 

鉴于HK1在心血管疾病诊断和治疗方面的应用前景，国外已有关于HK1含量检测的ELISA试剂盒，但是其操作过程繁琐并且价格昂贵难于获得。目前，国内尚无此类的高效检测试剂盒。而建立具有高灵敏度、高特异性的人组织激肽释放酶含量测定ELISA试剂盒，需要制备特异性强，效价高并可以大量生产的抗人组织激肽释放酶的抗体。本发明利用表位设计软件设计了一段位于KLK1尾端的特异性12肽序列并采用单抗制备技术制备了高效价、高特异性并方便大量生产的抗人组织激肽释放酶的单克隆抗体。此抗体为针对KLK1的一段特异性表位的单克隆抗体，国内外均无针对此表位的单克隆抗体，为研制高效性的人组织激肽释 放酶含量检测的ELISA试剂盒打下了坚实基础。 

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性强、效价高、只针对一段特异性表位并可大量生产抗人组织激肽释放酶的单克隆抗体。 

本发明的另一目的是提供一种抗人组织激肽释放酶的单克隆抗体的制备方法。 

本发明的再一目的是提供一种抗人组织激肽释放酶的单克隆抗体在制备人组织激肽释放酶含量检测的ELISA试剂盒中的应用。 

本发明的还一目的是提供一种分泌特异性抗人组织激肽释放酶的单克隆抗体的杂交瘤细胞株HTK。 

本发明所述的抗人组织激肽释放酶的单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞株HTKCCTCC-200928产生的。 

本发明所述抗体是针对人组织及肽释放酶尾端的一段12肽的特异性单克隆抗体细胞株； 

是由杂交瘤细胞株HTK在小鼠体内诱生腹水并纯化而成的； 

具有较高的亲和力，较强的特异性； 

可用于Western bloing及ELISA试剂盒的制备； 

其采用的多肽序列：NH2-Cys-Lys-Trp-Ile-Glu-Asp-Thr-Ile-Ala-Glu-Asn-Ser-COOH。 

本发明所述的抗人组织激肽释放酶单克隆抗体方法，其特征在于包括如下步骤： 

1)将人工合成的人组织激肽释放酶尾端的12肽分别与KLH和BSA交联作为免疫原和包被原； 

2)免疫小鼠； 

3)筛选出血清效价最高的小鼠； 

4)取脾与骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞株； 

5)筛选出杂交瘤细胞株HTK； 

6)扩大培养杂交瘤细胞，并将其注入小鼠腹腔内诱生腹水； 

7)纯化腹水后即为抗人组织激肽释放酶单克隆抗体。 

本发明所述的杂交瘤细胞株HTK CCTCCNO：C200928，已于2009年4月27日保藏在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。 

本发明所利用的合成肽为人组织激肽释放酶尾端的一段由12个氨基酸组成的多肽，其本身不具有抗原性，只具有免疫原性，不能直接刺激动物产生抗体，必须与大分子蛋白偶联制备成人工抗原，才能刺激机体产生特异性抗体。 

本发明所述的抗人组织激肽释放酶单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：先将合成肽分别与血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白偶联制备免疫原(12P-KLH)和包被原(12P-BSA)，然后通过小鼠免疫，细胞融合，筛选出杂交瘤细胞株，再进行培养，纯化成单克隆抗体。 

其中，本发明所述的免疫原，是采用戊二醛交联法将合成肽(12P)和载体雪蓝蛋白(KLH)偶联成的。用该免疫原免疫Blab/c小鼠，小鼠血清效价能达到1∶25，600。 

所述的人组织及肽释放酶包被原，是用戊二醛法将合成肽(12P)和牛血清白蛋白(BSA)偶联而成的。