[发明专利]人组织激肽释放酶ELISA试剂盒的制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种人组织激肽释放酶融合蛋白，是一种人组织激肽释放酶含 量检测的ELISA试剂盒。

背景技术

人组织激肽释放酶(HK1)是一类丝氨酸蛋白酶，能促进低分子激肽原释放血管 活性肽从而发挥一系列生物活性作用，命名为KLK1。在人和动物的高血压、心 血管疾病和肾脏疾病的模型中，均可见到HK含量的降低。我们在转基因的动物 模型中发现HK1具有降低血压，改善胰岛素抵抗，改善肾功能的作用。HK1的 水平在人的心血管疾病及肾脏疾病的发生发展的过程中可能具有重要的预测价 值。因此，建立HK1含量测定的高效检测试剂盒在临床和科研上均有重要的意义。

鉴于HK1在心血管疾病及肾脏疾病中的预测及治疗价值，国外已有KLK1的 含量测定ELISA试剂盒。其采用的方法为竞争ELISA法，所用的抗体为一种多克 隆抗体。因此，其方法复杂，计算繁琐，易于产生非特异显色而导致结果误差较 大并且价格昂贵不符合中国国情，而国内又无此类的试剂盒。针对上述存在的这 些问题发明人将采用了最新的双抗体夹心ELISA技术，并加入了生物素-亲和素 系统从而简化了操作过程，提高了特异性及灵敏度。我们利用HK1的多克隆抗体 包被ELISA板，能尽可能多的捕获到HK1的融合蛋白及HK1，生物素化的单克隆 抗体(生物素-HTK)能特异性地识别ELISA板上的HK1的一段特异性的表位。因 此，我们生产的人组织激肽释放酶ELISA试剂盒具有灵敏度高，特异性强，操作 简便的特点，更重要的是更为经济适用。

发明内容

本发明的目的是提供一种人组织激肽释放酶含量测定的ELISA试剂盒。

实现本发明技术方案如下：

一种人组织激肽释放酶含量测定的ELISA试剂盒，其特征在于：

a)该试剂盒采用的方法为双抗体夹心法；

b)加入了生物素-亲和素放大系统；

c)标准品为原核表达并纯化的人组织激肽释放酶；

d)其包被抗体为抗人组织激肽释放酶的多克隆抗体，检测抗体为其生物素 化的单抗；

e)灵敏度为0.3ng/ml-500ng/ml。

人组织激肽释放酶含量测定的ELISA试剂盒的方法，其特征在于包括如下 步骤：

a)1∶6400倍稀释的包被抗体包被ELISA板，并置于4℃孵育24小时；

b)1％BSA封闭1小时；

c)倍比稀释标准品，并分别加入标准品及1∶10倍稀释的样品，于37℃反 应60分钟；

d)加入1∶800倍稀释的检测抗体并于37℃孵育40分钟；

e)加入1∶2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素25分钟。

f)TMB显色并读数。

特异性人组织激肽释放酶融合蛋白多克隆抗体包被反应板的制备方法，通过 下列步骤制备而成：

1)人组织激肽释放酶融合蛋白的获得：

a.人组织及肽释放酶融合蛋白(HK-4T1)的原核表达：以pcDNA-HK为模板， 用特异性引物PCR扩增KLK1目的基因，目的基因克隆于PEGX-4T1原核表达载体， 转化DH5α感受态细菌。根据氨苄青霉素抗性提取克隆，提取转化子的质粒DNA， 鉴定，得到与目的片段相一致的片段，判为阳性结果。将目的基因的重组质粒 HK/4T1转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导后，菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考 马斯亮蓝染色显示，大约在55KD处有一条浓染的新增蛋白条带。经Western bloting鉴定，能与人组织激肽释放酶单克隆抗体发生强阳性反应，HK-4T1融 合蛋白具有较强的免疫原性。

b.HK-4T1融合蛋白的大量表达、纯化：经过大量诱导，表达，包涵体纯化 得到大量的HK-4T1融合蛋白。

2)抗HK-4T1融合蛋白多克隆抗体的制备：将纯化的融合蛋白与弗氏完全佐 剂充分乳化后免疫家兔获得多克隆抗体，经亲和层析纯化作为包被抗体。

3)用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将包被抗体稀释成适宜浓度后，在每个 酶标板的反应孔中加入0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用PBST洗3次， 每次3分钟，然后拍干；得到人组织激肽释放酶融合蛋白多克隆抗体包被酶标板。