[发明专利]基于聚灿烂甲酚蓝碳纳米管复合电极的乙醇脱氢酶传感器

说明书

技术领域

本发明涉及一种乙醇脱氢酶传感器，尤其是涉及用聚灿烂甲酚蓝和碳纳米管复合电极，以及乙醇脱氢酶的固定化制备方法。

技术背景

生物体中绝大多数氧化还原反应都是在脱氢酶或氧化酶的催化下进行，其中脱氢酶尤为重要。脱氢酶作为生物体内的大分子是构成生命的主要基元，参与完成生命体中的新陈代谢等许多生理过程，在这些生命过程中，脱氢酶都要经历电子转移过程，在其氧化型和还原型之间相互转化。研究生物体中的电子传递过程能揭示生命过程的奥秘。脱氢酶的电化学研究是生物电化学界和生物学界非常关注的研究问题。它的研究对于深入认识酶在生命体内的生理作用及电子传递反应传递机制以及开发新型生物传感器、新型生物燃料电池等生物电子器件具有重要的理论和应用指导意义。

基于生物识别的高度专一性与电化学信号检测的放大作用相结合的电化学生物传感器，具有灵敏度高、选择性好、易于微型化和自动化等优点，在生物分析和环境检测等领域应用广泛。早在20世纪60年代，生物催化功能就已被用于电化学生物传感器的研制。但主要使用氧化酶作为生物敏感材料，如葡萄糖氧化酶、过氧化物酶等，通过检测氧化酶催化的生物反应中消耗的氧气或产生过氧化氢，可以间接测定底物的含量(第一代电化学生物传感器)；或者使用电子媒介体，改变催化反应的路径，达到测定底物的目的(第二代电化学传感器)，如目前市场上大多数血糖仪就是采用电化学测定葡萄糖氧化酶反应过程中产生的电流，而得出血糖值。

采用葡萄糖氧化酶的血糖仪在测定血糖值时，氧的影响是不可避免的，因为在电子向电极转移时氧与介质竞争，高浓度氧可导致血糖值信号偏低，而低浓度氧则可导致血糖值信号偏高。正像电化学干扰因素一样，氧的影响在低糖时最明显，这一影响通常太明显，以至这些试纸不能用于所有来源的血样(静脉、毛细血管和动脉血)的测定。采用葡萄糖脱氢酶作为葡萄糖反应的酶，可避免这一问题。与葡萄糖氧化酶不同，葡萄糖脱氢酶反应过程不需氧的参与，氧的影响大大降低，稳定性更高，测试结果更准确。因此，用电化学方法研究脱氢酶的氧化还原反应，为构筑脱氢酶生物传感器提供理论和实验基础，具有广阔的应用价值和前景。

脱氢酶反应过程虽然不需氧的参与，但需要NAD(P)作为辅基参与电子的传递。令人遗憾的是NAD-NADH在电极上的氧化还原行为是不可逆的，NAD进行电化学还原不能得到NADH，而是产生一种二聚物。NADH经电化学氧化生成NAD，但过电位较大，NADH在玻碳电极上于+0.75V的电位下再循环利用，电位明显高于其标准电位-0.32V。因此降低NADH的氧化过电位，对NADH高效的催化氧化，是构建电化学脱氢酶生物传感器的先决条件。将染料如亚甲蓝、硫堇、亚甲绿和灿烂甲酚蓝等固定在电极表面，研制成对NADH有良好催化活性的仿生界面，降低NADH氧化过电位可达500-600mV。固定的方法有：吸附法，现场电化学聚合法及自组装膜法等。吸附型仿生界面的最大缺点是不稳定；现场电化学聚合法中酶的损耗较多；自组装膜法耗费时间较长。因此研究酶及媒介体的固定方法是解决传感器稳定性的关键。

纳米粒子具有独特的化学性质和物理性质，如表面效应、微尺寸效应、量子效应和宏观量子隧道效应等，纳米技术引入生物传感器领域后，提高了生物传感器的检测性能，并促发了新型的生物传感器。因为具有了亚微米的尺寸、换能器、探针或者纳米微系统，生物传感器的化学和物理性质和其对生物分子或者细胞的检测灵敏度大幅提高，检测的反应时间也得以缩短，并且可以实现高通量的实时检测分析。

纳米技术构筑脱氢酶生物传感器，已有一些报道，如瑞典Gorton教授的课题组进行了系统的研究。我国中科院长春应化所、南京大学、南京师范大学的一些课题组也进行了有效的探索。其方法主要是利用碳纳米管或金纳米溶胶修饰电极，作为附载酶或媒介体的载体，以吸附法和包埋法固定媒介体和酶，构筑脱氢酶传感器。这些研究为构筑脱氢酶生物传感器提供了新的思路和方法。构筑脱氢酶电化学传感器，需要解决的问题还很多，如选择合适的纳米材料和适宜的纳米技术构筑纳米仿生界面，NADH有效的循环再利用，选择合适的媒介体，选择合适的固定化材料和方法以保持酶的活性等等。

利用聚灿烂甲酚蓝催化氧化NADH，有一些报道，但大多采用循环伏安法在玻碳电极表面制备聚灿烂甲酚蓝。制备聚灿烂甲酚蓝/碳纳米管修饰电极及构筑乙醇脱氢酶传感器还未见报道。

发明内容

本发明涉及一种乙醇脱氢酶传感器，尤其是涉及用聚灿烂甲酚蓝和碳纳米管复合电极，固定化乙醇脱氢酶等制备方法。