[发明专利]一种DNA银染方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种DNA银染方法，尤其涉及一种对变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)中DNA的银染及显色方法。

背景技术

聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)是分析蛋白质和核酸样品的一种常用的方法，由于其具有较高的分辨率，在分子生物学及相关学科的研究中得以广泛的应用，尤其在AFLP、SSR、SNP等分子标记研究和遗传图谱构建等方面应用更多。电泳后对样品的显示有许多的方法，目标产物的检测主要采取显色法，目前采用的显色法大体有如下几种：(1)同位素放射自显影法，(2)荧光染料标记法，(3)溴化乙锭染色法，其中，同位素放射自显影法具有灵敏度高、可靠性强等优点，但必须使用同位素标记、凝胶转移、自显影等步骤，操作过程比较繁琐，且操作者易遭受同位素照射的危险，需要外加特别的设备和防护措施，因而在推广应用中有一定的难度；荧光染料标记法虽然克服了方法(1)中同位素对人的危害性，但同时也降低了检测的灵敏度，并且操作过程同样繁琐，试验成本也较高，需要有荧光显微镜等设备；溴化乙锭(EB)染色法方便易行，但聚丙烯酰胺对溴化乙锭EB的荧光有猝灭作用，大大降低了溴化乙锭染色灵敏度，小于10ng的DNA条带很难检测到，另外，往往要求产物的量较大，且EB具有致癌性，使得对凝胶的操作和处理变得复杂起来。

采用银染法，可以有效地克服以上三种常见凝胶染色法的缺点，银染法的基本原理为：先用固定液将核酸固定到凝胶上，然后使银染液中的银离子与之牢固结合，再通过还原剂将银离子还原，从而发生了显色反应，使得目标产物能够凭肉眼即能看见。银染法对试剂的要求相对不高，一般国产分析纯试剂即可满足要求，并且固定液和染色液可以重复使用，降低了实验成本，银染后的凝胶可以长期保存，更有利于对实验结果的回顾性分析。在目前的分子生物学研究上具有广泛的推广价值。目前较常用的是Bassam(1991)和Sanguinetti(1994)的银染法，同时很多研究者根据自己的实践提出了不少改进的银染法(Rder et al.，1998；许绍斌等2002)，主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色，其灵敏度比EB高200倍，但银染色后DNA不宜回收。银染法是迄今为止灵敏度最高的一种染色法，现有的银染法大都存在有以下缺点：(1)可能造成很高的背景特别在水不够纯的情况下；(2)费时费力(需要1～2h)；(3)费用昂贵；(4)需要接触有毒的物质较多。目前，常用的银染方法主要包含下面几个步骤：(1)预处理与固定；(2)染色；(3)显色；(4)终止反应。整个过程比较繁琐，需要用到去离子水、乙醇、硝酸、硝酸银、碳酸钠、甲醛、硫代硫酸钠及乙酸等多种化学试剂。现有的银染方法均需要采用乙醇或/和乙酸来终止显色，所用到试剂较多，操作步骤相对较为复杂，相应地显色时间较长。目前所采用的银染方法每次染色时需配固定液，显影液及染色液，染色液还要事先进行预冷等，同时在显影过程后期显影速度很快，它要求带型显出时及时终止反应，如把握不当，随着染色时间的延长，会使胶越染越黑，降低DNA带型与背景的对比度，染色效果较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作时间短，使用试剂少的对变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)中DNA的银染方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案在于采用了一种DNA银染方法，该方法的步骤如下：

(1)电泳结束后切断电源，从电泳槽中倒出缓冲液，然后取下胶板，放入装有蒸馏水的瓷盘中，用蒸馏水漂洗2—3次；

(2)银染：加入染色剂进行银染，并用手或摇床不停摇动，染色8—12分钟，然后用蒸馏水漂洗2—3次；

(3)显影：加入显影剂进行显色，并用手或摇床不停摇动，显影8—12分钟，至目的条带清晰为止；

(4)用蒸馏水漂洗2—3次；

(5)凝胶摄影：将凝胶平铺于X线胶片观片灯上照相。

步骤(2)中的染色剂由0.1—0.2％的AgNO₃与10％的无水乙醇组成。

优选地，步骤(2)中的染色剂由0.2％的AgNO₃与10％的无水乙醇组成，0.2％硝酸银染色后，带型显色更深，更快，灵敏度更高；染色过程中加入10％的无水乙醇，后续显色过程快，条带不飘移，带型整齐。

步骤(3)中的显影剂由2—3％的NaOH和0.2—0.4％的甲醛组成。

优选地，步骤(3)中的显影剂由2—3％的NaOH和0.3％的甲醛组成。