[发明专利]一种鉴定鲢鱼幼苗性别的分子生物学方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种分子生物学，特别是一种鉴定鲢鱼幼苗性别的分子生物学方法。

背景技术：

我国有着丰富的鱼类资源，其中许多鱼类在生长速率上存在着性别差异，因此，开展这些鱼类性别决定相关基因及性别特异标记的研究对于鱼类性别控制具有很高的理论指导意义。鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)又叫白鲢、水鲢、跳鲢、鲢子，属于鲤形目，鲤科，是著名的四大家鱼之一。著名的特产经济鱼类，养殖历史悠久，在我国池塘、湖泊、水库均有养殖，且养殖产量一直居我国淡水养殖之首。鲢鱼雌性生长发育快，生长迅速。目前人工雌核发育与激素性反转结合创造全雌性的养殖群体是鲢鱼育种的主要方向。但是由于鲢第一次性成熟需3～4年，在幼苗时期根本无法通过外观形态来判断其性别特征，所以怎样从幼苗群体中，简单快速的识别出遗传性别成为制约鲢鱼成功选育的先决条件。

RAPD技术是近几年出现的，可以快速寻找分子标记的一种有效方法。用它在某些动物的基因组中寻找性别标记已有成功报道。如在虹鳟鱼基因组中找到了两个雄性特异的分子标记，可以作为识别雌雄的探针。Kovacs等2000年用RAPD扫描非洲鲶鱼(Clarias gariepinus)雌、雄基因池，找到两个雄性性别相关的RAPD标记。

发明内容：

本发明的目的是提供一对鲢鱼雄性特异性引物序列和一对对照管家基因引物序列。

本发明的另外一个目的是提供一种能快速鉴别鲢鱼幼苗性别的方法。

本发明的技术方案是，鲢鱼DNA分子鉴定性别的特异性片段，其特征在于：该特别片断的序列命名为Hmmf。鲢鱼幼苗DNA分子鉴别的雄性特异引物，其特征在于：该引物是由Hmmf序列设计合成的，该引物序列命名为Hmmf1和Hmmf2，对照管家基因引物是通过在NCBI网络搜索到的鲢鱼管家基因GAPDH设计合成的，其引物序列命名为Gapdh1和Gapdh2。一种鉴定鲢鱼幼苗性别的分子生物学方法，其特征在于：利用设计的特异引物Hmmf1和Hmmf2，以及对照管家基因GAPDH的引物Gapdh1和Gapdh2，以鲢鱼个体基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25μl，反应组成为1U的Taq DNA聚合酶，2μl的dNTP，100～200ng基因组DNA，其中含雄性特异上下游引物及管家基因上下游引物各0.1μmol/L，在PCR仪上按下面的循环参数进行PCR扩增：95℃预变性5min后，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸60sec共30个循环，最后72℃延伸10min，扩增产物以1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下观察并拍照记录，100bp DNA ladder作分子量标记，该方法中对照管家基因GAPDH的扩增带在雌雄个体中均稳定存在，出现大小为800bp目的条带的是雄性个体，没有条带的即为雌性个体。本发明与现有技术比较具有能对鲢鱼幼苗进行性别鉴定且鉴别准确率高的显著优点。

附图说明：

图1为利用特异PCR法对性别特异片段的验证结果。在雌雄10个个体中，对照管家基因条带在所有个体中清晰可见，证明PCR扩增程序没有问题。1，2，3，4，5泳道都出现了大小为800bp的扩增带，均为雄性个体；而6，7，8，9，10除管家基因外没有扩增出任何条带，均为雌性个体。M为100bp梯度的DNA分子量标准。箭头1所指为大小为800bp的雄性特异条带；箭头2所指为对照基因条带。

图2为利用雄性特异引物和管家基因引物的鲢鱼幼苗性别鉴定结果。随机选取13个鲢鱼幼苗个体进行性别鉴定。其中1，2，3，4，5，9，10，11八个个体的电泳带上有一个800bp大小的条带，为雄性个体；6，7，8，11，12五个个体在800bp位置上没有条带，为雌性个体。但管家基因条带在雌雄个体中都出现。M为100bp梯度的DNA分子量标准。箭头1所指为大小为800bp的雄性特异条带；箭头2所指为管家基因条带。

具体实施方式：

雄性特异引物的获得以及性别特异性的验证