[发明专利]一种多顺反子表达载体构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及表达载体的构建方法，特别涉及一种多顺反子表达载体的构建方法。

背景技术

通常蛋白质的表达方法是将待克隆的目的基因与载体连接，将该重组子转化到受体菌中，筛选鉴定正确的克隆进行扩增，再将其转入宿主细胞中表达。这是目前蛋白质表达研究中运用最多的方法，但表达量低一直是蛋白质表达研究的一个瓶颈问题。为提高表达量，科学家采取了不同的改进措施，如串联表达(Dai，et al.Mar Biotechnol，DOI 10.1007/s10126-008-9125-6)和多顺反子表达(杨利军，等.中国生物工程杂志，2006，26 11：45～47)等。在上述构建表达载体的方法中，需要合成的引物多，要求PCR扩增的次数多，涉及的限制性内切酶多，涉及的实验步骤多，繁琐费时。另外，采用串联表达，表达产物多以多聚体形式存在。如果表达产物为药用蛋白质，可能会妨碍蛋白质在体内的运输，或多聚体形式影响蛋白质功能的发挥。因此，从目的蛋白功能发挥方面考虑，不如多顺反子表达。

发明内容

本发明的目的旨在克服现有技术存在的上述缺陷。提供一种生产成本低，操作简便快捷的多顺反子表达载体构建方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：本发明的多顺反子表达载体构建方法，是利用T-载体作为中间载体，设计两对引物，在引物中引入NheI和SpeI酶切位点及核糖体结合位点(RBS)，以含目的基因的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物重组到T-载体上，将得到的重组T-载体用NdeI+NheI、NdeI+SpeI双酶切，所得DNA片段用DNA连接酶连接，就能使单个异源基因以2n-1(n为上一步重组T-载体含目的基因个数)的方式在T-载体上递增；最后将含多个异源基因的DNA片段，通过对应于其两端酶切位点的限制性内切酶切下，亚克隆到表达载体启动子下游，即可得到多顺反子表达载体。

其构建方法的具体步骤如下：

1)设计引物(在设计引物时，引入NheI和SpeI两种限制性内切酶位点。利用两种限制性内切酶是同尾酶的特点，经NheI和SpeI酶切的DNA片段可以用DNA连接酶连接，连接后的DNA片段，两种限制性内切酶的酶切位点消失，以利于后续NheI和SpeI酶切操作。)

a、根据待扩增的目的基因序列，设计两对引物，在第一对引物的下游引物P_1下5′端引入NheI酶切位点，在第二对引物的上游引物P_2上5′端引入NheI酶切位点，在第二对引物的下游引物P_2下5′端引入SpeI酶切位点；

b、根据T-载体和表达载体多克隆位点结构特点，在引物中引入亚克隆用酶切位点；

为便于亚克隆到表达载体中，可以在第一对引物的上游引物P_1上5′端引入合适的酶切位点，在第二对引物的下游引物P_2下的SpeI酶切位点5′端引入另一个合适的酶切位点，如果选用T-载体多克隆位点处的限制性内切酶位点进行亚克隆操作，就不必在引物中另外引入限制性内切酶位点；

c、根据表达载体的特点，在引物中引入起始密码子、终止密码子的反义密码子和核糖体结合位点(RBS)或RBS的互补序列；

如果表达载体是分泌表达载体，由于载体启动子下游存在信号肽序列，设计的上游引物中不用引入起始密码子，下游引物中酶切位点3′端与目的基因的互补序列5′端之间需引入终止密码子的反义密码子，同时第二对引物的上游引物NheI酶切位点3′端与目的基因序列5′端之间需引入核糖体结合位点和信号肽序列；

如果表达载体不是分泌型表达载体，且亚克隆时，酶切位点处可产生起始密码子，如NdeI酶切位点，则第一对引物的上游引物不用引入起始密码子，第一对引物的下游引物需在NheI酶切位点3′端和目的基因互补序列5′端之间依次引入1～6个任意额外碱基，核糖体结合位点的互补序列和终止密码子的反义密码子序列；在第二对引物的上游引物NheI酶切位点3′端与目的基因序列5′端之间引入起始密码子，第二对引物的下游引物SpeI酶切位点3′端与目的基因的互补序列5′端之间引入终止密码子的反义密码子。