[发明专利]包埋玻璃化超低温保存山药种质的玻璃化保护剂及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种种质保存技术，特别是一种包埋玻璃化超低温保存山药种质的玻璃化保护剂及其应用。

背景技术：

山药既是一种深受人们喜爱的食品，又是一种药用价值很高且应用广泛的中药材，尤其怀山药，其药用价值更高。然而，对山药种质的保存技术仍沿用传统的方法，许多珍贵种质资源丢失，不能适应现在日益增长的需求量的要求。超低温保存技术是目前保存期长、品质稳定、应用成熟的一种种质保存方法。20世纪90年代出现了包埋玻璃化法超低温保存技术，它综合了玻璃化法和包埋脱水法的优点，而克服了包埋干法操作繁琐及细胞内外冰晶的形成和玻璃化法的毒性。目前已在苹果、薄荷、草莓、柿、山葵、甘薯、大蒜等得到成功应用。此种方法由继代培养、低温练苗、预培养、包埋、装载和脱水处理、液氮保存、保存后化冻和洗涤及再生培养等环节组成。然而，经过试验这种方法在山药种质的保存中应用未能成功，经研究其原因之一是脱水的玻璃化保护剂不适于山药种质。

发明内容：

本发明的目的是提供一种能将包埋玻璃化超低温保存技术应用于山药种质保存的玻璃化保护剂及其应用。本发明的技术解决方案是，包埋玻璃化超低温保存山药种质的玻璃化保护剂，包括甘油、乙二醇、二甲基亚砜和聚乙二醇，其特征在于：甘油的浓度为30％、乙二醇的浓度为15％、二甲基亚砜的浓度为10％和聚乙二醇的浓度为15％的混合液。包埋玻璃化超低温保存山药种质的玻璃化保护剂的应用，其特征在于：将经过装载液处理后的山药种质置于玻璃化保护剂溶液中在0-25℃下脱水20-120分钟。本发明与现有技术比较具有操作方便、保存时间长且保存后山药种质遗传稳定性好的显著优点。

具体实施方式：

本发明的玻璃化保护剂与原包埋玻璃化超低温保存技术中的玻璃化保护剂的不同之处是各成份的浓度不同。经过大量试验研究对其浓度进行了改进获得了成功，该保护剂的组成及其浓度为30％的甘油、15％的乙二醇、10％的二甲基亚砜和15％的聚乙二醇的混合液。

上述保护剂对山药种质进行包埋玻璃化超低温处理中的应用方法是，将经过装载处理后怀山药种质在上述玻璃化保护剂中在0～25℃下脱水20-120分钟，然后依次进行液氮保存、化冻、洗涤、再培养。包埋玻璃化法超低温保存怀山药种质的技术：将继代培养50～70d的怀山药试管苗，于4℃低温下锻炼7～30d，在无菌条件下切取1cm左右的带芽茎段，放入MS+0.1mol·L^-1蔗糖+0.1mol·L^-1甘油或MS+0.2mol·L^-1蔗糖预培养基中4℃下恒定培养3～5d，然后将材料切成2mm左右的带芽茎段，室温下与含2～3％海藻酸钠和0.2mol·L^-1蔗糖的MS培养基混合，将混合液滴入含有0.5mol·L^-1CaCl₂和0.2mol·L^-1蔗糖MS培养基中进行包埋，包埋时间为20～35min，使之形成包埋珠(每个包埋珠含一个带芽茎段)；将包埋珠用装载液在0℃下装载30～120min，然后用玻璃化保护剂在0℃下脱水30～120min或25℃下脱水20～60min。，迅速投入液氮保存；在液氮中保存1～360d后，立即将包埋珠放入37～42℃水浴中快速化冻1～3min，化冻后用含0.3～1.0mol·L^-1蔗糖的MS洗涤液洗涤包埋珠2次，每次8～15min，转入再生培养基(MS+KT1mg·L^-1+TDZ 0.02mg·L^-1+NAA 0.02mg·L^-1)中，先于暗处培养7～20d，再转到光下培养，可长成正常植株。

通过对保存时间和保存后再生植株的遗传稳定性的研究发现：保存时间对材料的相对存活率和成活率均没有影响；再生植株与常温保存苗相比，株高、叶片数、芽数、茎节长、叶绿素和可溶性蛋白的含量、SOD、POD、PPO和淀粉酶的同工酶酶谱以及RAPD条带均未出现变异。