[发明专利]嗜热脂肪芽孢杆菌及抗生素残留检测方法

权利要求书

1.一种嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)2009，其保藏编号为CGMCCNO.3287。

2.一种β-内酰胺类抗生素残留检测方法，包括以下步骤：

(1)菌株活化

将权利要求1所述的嗜热脂肪芽孢杆菌CGMCC NO.3287菌株接种于斜面培养基上，调节培养基的pH值为6.8～7.2，于50～65℃下进行优化培养，并进行转种继代培养；

(2)芽孢富集悬浮

加热离心法：将斜面菌种在50～65℃下培养3～5天，用生理盐水洗下菌苔，转移至无菌容器中，充分振荡后，过滤，制成悬浮液，于70～80℃下加热悬浮液10～15min，静置过夜后，以2000r/min离心10～20min，取上清液，4000r/min离心10～20min，弃去上清液，如此反复离心洗涤4～5次后，用生理盐水将离心沉淀悬浮成芽孢悬浮液，调整其OD₆₀₀值至0.25～0.35，于0～4℃下贮存、备用；

(3)紫色培养液配制

以重量百分比计，取葡萄糖、蛋白胨及水配制成葡萄糖为1％、蛋白胨为1％、pH值为7.0～7.3的培养液，滤膜过滤灭菌后于每100mL营养液中加1.6％的溴甲酚紫溶液0.05～0.07mL；

(4)芽孢杆菌的胶体包埋

取琼脂加热溶解于紫色培养液中制成琼脂重量百分含量为1～2％的紫色培养基，取0.1～0.4mL芽孢悬浮液与50～100mL温度为50～65℃的紫色培养基快速混匀，并迅速分装于检测小管中，于0～4℃下直立静置，密封后0～4℃下保存、备用；

(5)样品检测

检测牛奶样品于80～85℃水浴加热10min，冷却至50～60℃，取该检测牛奶样品0.05～0.1mL加到所述检测小管中，密闭封口后于50～65℃水浴培养150min，培养液由蓝紫色变为黄色为阴性样品，培养液仍为蓝紫色则呈阳性样品。

3.根据权利要求2所述的β-内酰胺类抗生素残留检测方法，其特征在于，以下述溶菌酶法替代步骤(2)中所述加热离心法：

将活化斜面菌种接种到磷酸盐缓冲液中，70～77℃加热10min，置于营养琼脂培养18～20h，用生理盐水洗下菌苔，将菌液移种于芽孢培养基中，于55～65℃下培养4天，用10mL生理盐水洗下菌苔，并进行充分混合，以4000r/min离心15min，弃去上清液，加入含有溶菌酶的磷酸盐缓冲液，37℃温育1h，温育后离心沉淀，弃上清液，如此反复离心洗涤5～6次，用生理盐水将离心沉淀悬浮成芽孢悬浮液，将嗜热脂肪芽孢杆菌悬浮液OD₆₀₀值调整到0.25～0.35，在0～4℃条件下贮存、备用。

4.根据权利要求2所述的β-内酰胺类抗生素残留检测方法，其特征在于，以下述芽孢杆菌的包埋方法替代所述步骤(4)：

取1～4mL芽孢悬浮液与15～20mL 1.5％海藻酸钠混匀，将其加入100～200mL 5％的CaCl₂溶液中，于4℃静置6h，抽滤出凝胶颗粒，用生理盐水洗净，每个检测小管内放入2～3个海藻酸钙凝胶珠，密封于0～4℃下保存，备用；

且以下述方法替代所述步骤(5)：

原料奶样品于80～85℃水浴加热10min，冷却至50～60℃备用，检测时，分别向装有海藻酸钙凝胶珠的检测小管中加入0.2～0.3mL紫色培养液，再加入检测牛奶样品0.05～0.1mL，密闭封口，于50～65℃水浴培养150min，培养液由蓝紫色变为黄色为阴性样品，培养液仍为蓝紫色则呈阳性样品。