[发明专利]检测Cre位点特异重组酶活性的转基因报告猪及培养方法

权利要求书

1.一种重组胚的构建方法，其具体步骤如下：

1).猪卵母细胞的采集和成熟培养及去核操作

从屠宰场收集猪的卵巢，置于25-37℃含有双抗生理盐水的保温瓶中，在2小时内返回实验室，用37℃含双抗的生理盐水洗涤数次，将卵巢置于37℃水浴锅中，用带有18号针头的20ml注射器抽吸卵巢上2-8mm的卵泡，在实体显微镜下用捡卵针挑选出细胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体，在成熟培养基中培养成熟以后，采用盲吸的方法去除卵丘细胞，准备核移植；

2).供体细胞的制备

将所构建的条件性表达绿色荧光蛋白的猪胚胎成纤维细胞从液氮罐中取出，迅速进行复苏，复苏后的细胞完全汇合后用于核移植操作，在进行核移植操作前，将供体细胞从培养箱中取出，进行消化吹打制成细胞悬液，将细胞悬液分装到1.5ml的离心管中，用含10％血清的TL-HEPES洗一遍，然后250g离心10分钟，重悬在0.5ml的DPBS中，备用，放入4℃冰箱内备用，进行核移植操作前20min将细胞从冰箱中取出放入38.5℃培养箱中温热，用时用移液枪吸取离心管底部10ul的细胞悬液加入已经做好的操作滴内，覆盖上石蜡油；

3).卵母细胞的注核操作

在显微操作台上的培养皿中的中间的滴内放去核的卵母细胞，每次放10-15个，另外几个放入供体细胞，首先用内径为10-15μm的注核针吸取小而圆的供体细胞，然后移动操作台使卵母细胞处在视野下面，用固定针固定卵母细胞，用注核针拨动卵母细胞，找到去核时在透明带留下的针口，将注射针插入到透明带下，将供体细胞注入卵母细胞的卵周隙内，构成一个卵-供体细胞复合体，而后缓慢抽出注核针，并对透明带进行整理，使供体细胞与卵母细胞膜相互接触，便于随后重组胚的融合；

4).融合

将操作完毕的重构复合体移入融合液，洗涤三次，然后移入融合槽中，使去核卵母细胞和供体细胞的接触面与电流方向垂直，然后进行电击，激活后的复合体迅速移入NCSU-23培养液中洗涤3-5次，然后放置入培养箱中，38.5℃，5％CO₂，100％湿度培养箱中培养；

其中，步骤2)中所述条件性表达绿色荧光蛋白的猪胚胎成纤维细胞构建方法如下：将构建的条件性表达绿色荧光蛋白的pICE-STOP载体线性化后，利用脂质体LipofectamineTM2000转染小型猪胚胎成纤维细胞，用G418筛选5～7天后，获得抗性细胞，采用一系列的方法对所获的细胞在基因水平、转录水平和翻译水平进行鉴定，获得了条件性表达绿色荧光蛋白的转基因猪的成纤维细胞，所述载体pICE-STOP构建方法如下：以PCI-Neo为模板，通过PCR循环扩增CMV启动子；以PBC-1为模板，通过PCR循环扩增绝缘子；以pEGFP-C1为模板通过PCR循环扩增eGFP基因；将所扩增的片段酶切回收后，分别连入STOP-eGFP-ROSA26TV载体。