[发明专利]结核分枝杆菌噬菌体随机肽库

权利要求书

1、结核分枝杆菌噬菌体随机肽库，其特征在于，是由下述方法制备的：

A、用现有技术方法提取结核分枝杆菌H37Rv基因组；

B、按H37Rv基因组12.0μl(DNA浓度4.8μg/μl)、DNaseI0.5μl、10×Buffer1.5μl比例配制反应系，温度16℃消化结核分枝杆菌H37Rv基因组；反应30min；加入1/10体积的EDTA(0.25M)终止反应，得随机基因片段50-80bp；

C、取脱磷酸的噬菌体M13KE和平端化的随机DNA片段进行连接，连接体系为：M13KE8μl、随机DNA片段25μl、10×Buffer-24μl、T₄DNA连接酶(NEB)3μl，总体积为40μl；电击参数为：2mm电击杯，电压2500v，电阻200Ω，电容25μF；电击后记录数为：电压2385v，时间3.4ms，分别于16℃连接16h；得结核分枝杆菌噬菌体随机肽库，用TU(transducting unit，TU)值来衡量，库容量为62×100×100＝6.2×10⁵/ml。

2、根据权利要求1所述的结核分枝杆菌噬菌体随机肽库，其特征在于，用常规M13方法对噬菌体的扩增，然后进行三轮淘选：

第一轮淘选

1)96孔酶标板，鹿结核阳性血清IgG溶液(100μg/ml)作为靶分子溶液；

2)包被：每孔加150μl①溶液，沿孔壁加入使表面完全润湿；

3)在增湿容器中4℃过夜；

4)封阻：倒掉包被液，用力拍甩以除去残余溶液；每孔加满封阻液，4℃作用1h；

5)倒掉封阻液，用TBST缓冲液快速洗板6次；倾去缓冲液，倒置在干净滤纸上拍甩以除去残余溶液；

6)取100μl用TBST缓冲液稀释的噬菌体展示基因组肽库(滴度为1.50×10¹¹)，加入到已封阻的酶标板上，温和摇动10～60min；

7)倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净滤纸上拍甩除去残余溶液；

8)按⑤中所述方法用TBST缓冲液洗板10次，每次换一干净的滤纸以避免交叉污染；

9)用非特异性缓冲液(0.2M Glycine-HCl，1mg/ml BSA)分离已结合的分子(温和摇动＞10min)，将洗脱液吸入另一干净微量离心管中，用15μlMTris-HCl中和；

10)常规M13方法测定洗脱物扩增前滴度；

11)将测定滴度后剩余的洗脱物扩增：将洗脱物加入到20ml ER2738培养物中(对数前期，OD₆₀₀≈0.6)，37℃、200rpm振荡培养4.5h；

12)将上述培养物转入一离心管中，4℃10,000rpm离心10min，上清转入另一离心管中，再离心；

13)将上清的上部80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃沉淀过夜；

14)4℃10,000rpm离心15min，倒掉上清液，再短暂离心，弃去残留上清液；

15)沉淀物重悬于1ml TBS中，悬液转入微量离心管中，4℃10,000rpm离心5min使残余细胞沉淀；

16)上清转入另一新鲜微量离心管中，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀；冰上孵育15～60min，4℃10,000rpm离心10min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清；

17)沉淀物重悬于200μlTBS，0.02％NaN₃中，4℃10,000rpm离心1min，上清转入新鲜管中，此即为扩增后的洗脱物；4℃贮存；

18)测定扩增后洗脱物滴度；

19)再包被一个板准备第二轮淘选时用；

第二轮淘选

1)第二轮淘选所用噬菌体的加入量为1.5×10¹¹pfu；

2)第二轮淘选：用第一轮淘选扩增的洗脱物重复第一轮筛选中的步骤，包被用的鹿结核IgG浓度为50μg/ml(用0.1M PH8.6NaHCO₃稀释100μg/ml的鹿结核IgG)，在清洗步骤中将Tween-20的浓度增至0.5％(v/v)；

3)测定第二轮淘选所得的洗脱物扩增后的滴度；

4)再包被一个板准备第三轮淘选时用；

第三轮淘选

用第二轮淘选扩增的洗脱物重复第一轮筛选中的步骤，第二轮淘选所用噬菌体的加入量为1.5×10¹¹pfu，包被用的鹿结核IgG浓度为25μg/ml(用0.1M PH8.6NaHCO₃稀释100μg/ml的鹿结核IgG)，在清洗步骤中将Tween-20的浓度增至0.5％(v/v)。