[发明专利]一种中温α-淀粉酶高产菌株及其构建方法

权利要求书

1、一种中温α-淀粉酶高产菌株，其特征在于：其出发菌枯草芽孢杆菌AS1.108中温α-淀粉酶基因核苷酸序列如下：

SAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTAIQTSPINQVKEGN

QGDKSMSNWYWLYHPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSD

YAAISNEVKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLE

RALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYGSQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYA

NYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVESHDTYANDDEES

TWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITA

VNRFHNVMAGQHEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRY

DNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAVLYPDDIEIRCNTFFQ。

2、一种如权利要求1所述的中温α-淀粉酶高产菌株的构建方法，其特征在于：其步骤是：

(1)枯草芽孢杆菌AS 1.108中温α-淀粉酶基因的获得及原核表达载体的构建；

①获得：根据genebank中已报道的枯草芽孢杆菌淀粉酶基为依据，设计引物，利用PCR得到中温α-淀粉酶的成熟肽基因；

上游引物P1为：5-CGCGGATCC CTTACAGCACCGTCGATCAA-3，下划线部分为BamHI酶切位点；

下游引物P2：5-CCCAAGCTTAC TCAATGGGGAAGAGAACCG-3，下划线部分为HindIII酶切位点；

模板为枯草芽孢杆菌AS 1.108基因组DNA，其扩增的反应条件为：95℃预变性2min，以95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min 30s，扩增30个循环，再以72℃延伸20min，PCR扩增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下，用DNA试剂盒回收纯化，得到中温α-淀粉酶的成熟肽基因；

②重组质粒pET22b-amy的构建与鉴定：将得到中温α-淀粉酶的成熟肽基因和载体pET22b用BamHI和HindIII双酶切后，分别用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T4 DNA连接酶作用下定向连接amy至pET22b，将连接产物电击转化入DH5a感受态细菌中，在LA(Amp)培养基中筛选培养，挑取阳性克隆，培养后提取质粒，采用BamHI和HindIII双位点单、双酶切鉴定，测序；

(2)枯草芽孢杆菌AS 1.108中温α-淀粉酶基因的克隆和表达；

①.测序得到完整淀粉酶成熟肽基因，重新设计引物，更换酶切位点；

上游引物P3为：5-CCCAAGCTT AC CTTACAGCACCGTCGATCAA-3，下划线部分为HindIII酶切位点；

下游引物P4为：5-CGCGGATCC TCAATGGGGAAGAGAACCG-3，下划线部分为BamHI酶切位点；

模板为重组质粒pET22b-amy；扩增的反应条件为：95℃预变性2min，以95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min 30s，扩增30个循环，再以72℃延伸20min，PCR扩增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下，用DNA试剂盒回收纯化，得到PCR纯化产物；

②.重组质粒pWB980-amy的构建与鉴定：将PCR纯化产物和载体pWB980用BamHI和HindIII双酶切后，分别用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T4DNA连接酶作用下定向连接amy至pWB980，将连接产物化学转化入WB600感受态细菌中，在LA(Kan)培养基中筛选培养，挑取阳性克隆，培养后提取质粒，采用BamHI和HindIII双位点单、双酶切鉴定，测序。