[发明专利]一种酶法去除普鲁兰多糖提取获得β－聚苹果酸的方法

权利要求书

1.利用酶法去除普鲁兰糖获得β-聚苹果酸的制备方法，包括以下步骤：

第一步培养基的配制

(1)菌种活化培养基：土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH 4.0～4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min；

(2)种子培养基：葡萄糖8％，丁二酸铵0.3％，丁二酸0.2％，K₂CO₃0.04％，KH₂PO₄0.01％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，ZnSO₄·7H₂O5×10^-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO₃ 2％(单独灭菌)，pH 4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min；

(3)发酵培养基：葡萄糖12％，丁二酸铵0.3％，丁二酸0.2％，K₂CO₃0.04％，KH₂PO₄0.01％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，ZnSO₄·7H₂O 5×10^-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO₃3％(单独灭菌)，pH 4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min；

第二步菌种活化

将斜面菌种——出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan)转接PDA培养基，25℃活化培养3d～5d；

第三步种子培养

将第二步活化的斜面菌种接种于装有100mL第一步制得的种子培养基的500mL三角瓶中，在24～30℃，120～180r/m下培养48～90h；

第四步发酵培养

将第三步制得的种子培养液以8％～10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，在24℃～30℃，200r/m下培养7d～12d；

第五步分离提取

(1)普鲁兰多糖的降解：在第四步发酵结束后取发酵液，离心或过滤除去菌体，发酵过滤液(上清液)调节pH 5～7，添加普鲁兰酶6～11plu/mL，在30℃～60℃下，缓慢搅拌，反应60min～90min；

(2)β-聚苹果酸的提取：将第五步(1)中的发酵液冷却至室温，缓慢搅拌，加入无水甲醇使酶解后的发酵过滤液中甲醇终浓度为40％～60％(v/v)，将该混合液于室温下缓慢搅拌后放置过夜，获得的沉淀即为β-聚苹果酸粗品，将β-聚苹果酸粗品按1∶10(m∶v)溶于蒸馏水中，经5000r/m离心，除去小分子不溶物，真空浓缩后冷冻干燥得β-聚苹果酸。

2.根据权利要求1所述的降解普鲁兰多糖获得β-聚苹果酸方法，其特征在于，在β-聚苹果酸的提取过程中，发酵过滤液添加普鲁兰酶降解发酵过程中的副产物普鲁兰多糖，提取获得β-聚苹果酸。

3.根据权利要求1所述的降解普鲁兰多糖后提取获得β-聚苹果酸的方法，其特征在于，发酵过滤液调pH 5～pH 7后添加普鲁兰酶。

4.根据权利要求1所述的降解普鲁兰多糖后提取获得β-聚苹果酸的方法，具特征在于，发酵过滤液添加6～11plu/mL的普鲁兰酶，提取获得β-聚苹果酸。

5.根据权利要求1所述的降解普鲁兰多糖后提取获得β-聚苹果酸的方法，其特征在于，发酵过滤液在30℃～50℃下，添加普鲁兰酶，提取获得β-聚苹果酸。

6.根据权利要求1所述的降解普鲁兰多糖后提取β-聚苹果酸的方法，其特征在于，发酵过滤液添加普鲁兰酶，缓慢搅拌，反应30min～90min后，提取获得β-聚苹果酸。

7.根据权利要求1所述的降解普鲁兰糖后提取获得β-聚苹果酸的方法，其特征在于发酵过滤液降解普鲁兰糖后添加甲醇使甲醇终浓度为40％～60％(v/v)以获得β-聚苹果酸。