[发明专利]水环境中致病菌超敏感检测技术

权利要求书

1.水环境中致病菌超敏感检测技术及应用，其特征是由如下步骤组成：

(1)制备5种细菌的多克隆抗体

分别利用大白兔和昆明小鼠制备5种致病菌的多克隆抗体，ELISA法测定效价在1∶10000～1∶200000，采用饱和硫酸铵法和金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)亲和层析法纯化制备的多克隆血清；

(2)免疫纳米磁颗粒的制备

采用化学共沉淀法制备粒径为10nm～100nm的纳米磁颗粒，取纯化好的浓度为0.2mg/mL～1.0mg/mL某种致病菌兔多克隆抗体连接到1mL纳米磁颗粒上制成免疫纳米磁颗粒。

(3)免疫胶体金的制备

胶体金采用柠檬酸钠改良法制备，制备粒径为10nm～50nm的胶体金，将浓度为0.2mg/mL～1.0mg/mL的羊抗兔IgG连接至胶体金上即为免疫胶体金。

(4)压电传感器的检测

①石英晶振用piranha液进行洗涤，取浓度为0.2mg/mL～2.0mg/mL的SPA溶液10μl固定于压电传感器的石英晶振10～90min，检测频率变化。确定SPA的最佳固定浓度和时间后，取浓度为0.1mg/mL～1.8mg/mL的致病菌鼠多克隆抗体溶液10μl固定于压电传感器的石英晶振10～90min，检测频率变化。确定致病菌鼠多克隆抗体的最佳固定浓度和时间。

②按最佳固定浓度和最佳固定时间分别将SPA和抗体固定于压电传感器的石英晶振上，将不同浓度的致病菌液滴加于石英晶振上，检测频率变化；取10μl免疫磁颗粒滴加于石英晶振上，检测频率变化；取10μl免疫胶体金滴加于石英晶振上，检测频率变化。最后得出5致病菌的检测限。

2.根据权利要求1所述的水环境中致病菌超敏感检测技术及应用，其特征是所述的5种致病菌的多克隆抗体，ELISA法测定效价在1∶100000～1∶120000。

3.根据权利要求1所述的水环境中致病菌超敏感检测技术及应用，其特征是所述的纳米磁颗粒粒径约为50nm，连接的抗体浓度要求为0.5mg/mL。

4.根据权利要求1所述的水环境中致病菌超敏感检测技术及应用，其特征是所述的胶体金改良法为微波炉方法，制备的胶体金粒径约为20nm，连接的羊抗兔IgG浓度要求为0.5mg/mL。

5.根据权利要求1所述的水环境中致病菌超敏感检测技术及应用，其特征是所述的SPA的最佳固定浓度和最佳固定时间分别为1.2mg/mL和40min；抗体的最佳固定浓度和最佳固定时间分别为1.0mg/mL和60min。5种致病菌的检测限为10¹CFU/mL。