[发明专利]一种检测海水中病原菌污染的寡核苷酸微阵列技术

权利要求书

1.一种检测海水中病原菌污染的寡核苷酸微阵列技术，其特征在于，微阵列的43条探针序列如下：

2.按照权利要求1所述的一种检测海水中病原菌污染的寡核苷酸微阵列技术，其特征在于，该寡核苷酸微阵列技术使用方法如下：

(1)寡核苷酸微阵列制作：

1)制备探针稀释液：1×鲑鱼精DNA溶液(1g/L)，

2)制备探针溶液：用探针稀释液配置成0.1ug/μL探针溶液，

3)把探针溶液点于5cm×5cm尼龙膜基质上，80℃保温2小时；

探针点样顺序如下表：

  Vp710b  Keliarv  Vfu710b  Vvgpro  N1386  Sal-1  Cp-2  Con  Vpiapro  Val2  Vm710b  Tetglavm  N1385  PSE-3  Cp-1  Riverglavr  Val1  Vm710e  Vviapro  N1384  PSE-2  Str-2  Vf710e  Vp-n1  Mchar  Vh710e  Lis-3-RV  PSE-1  Str-3  vfl-n2  Hemglvm  Vc710e  Vh710b  Lis-2-RV  N1388  Sal-3  vfl-n1  Vp710e  Vc710b  Vfu710e  Lis-1-RV  N1387  Sal-2  Cp-3

(2)海水样本处理和DNA提取

1)样本处理

①取表层海水20L，分装于灭菌处理的塑料桶中，取得的海水在3h内进行处理；

②先用0.15毫米孔径筛子过滤除去悬浮物质，然后用Mini-pellicon system(Millipore，美国)进行加压过滤收集菌体，滤膜孔径为0.22μm(Milipo，美国)。每过滤2L海水对应一张滤膜，即每2L海水作为一个样本，每个采样点对应10个平行样本；

③用无菌水将滤膜上的菌体冲洗下来，并立即用10000r/min离心5min收集菌体。收获的菌体和杂质沉淀用于DNA抽提；

2)DNA提取

①海水菌体过滤得到样本的菌体和泥沙悬浊液12000r/min离心2min；

②沉淀物加入550μL的TE缓冲液(10mM Tris·HCl，1mM EDTA；pH 8.0)，反复吹打使之重新悬浮，加入30μL 10％SDS和15μL的蛋白酶K，混匀，37℃温育1h；

③加入100μL 5mol/L NaCl，混匀，再加入80μL CTAB/NaCl溶液(5g CTAB溶于100mL0.5M NaCl溶液中)，混匀，65℃温育10min；

④加入等体积的酚/氯仿/异戊醇充分混匀，离心4-5min，将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻柔颠倒混匀，-20℃放置20min；

⑤沉淀用1mL的70％乙醇洗涤，倒置干燥，重溶于50μL TE缓冲液；

⑥DNA样品煮沸5分钟然后在冰上淬火，-20℃保存备用；

(3)聚合酶链式反应和地高辛标记

1)扩增和标记体系：

试剂                        体系中各组分终浓度和体积(μL)

10×聚合酶链式反应Buffer    5.0μL

F-E-T                       10μmol/L(4.0μL)

B-E-T                       10μmol/L(4.0μL)

dNTP                        10mmol/L(0.3μL)

Digoxigenin-11-dUTP         25nmol/L(0.3μL)

DNA模板                     5.0μL

Taq DNA Polymerase          5U/μL(0.3μL)

双蒸水                      31.1μL

总计                        50.0μL

10×聚合酶链式反应Buffer：Tris-HCl pH8.5，100mmol/L；KCl，500mmol/L；

MgCl₂，15mmol/L；

2)聚合酶链式反应程序

①预变性阶段：            95℃5min

②第一循环阶段(5个循环)： 94℃30sec

                          54℃30sec

                          72℃50sec

③第二循环阶段(5个循环)： 94℃30sec

                          56℃30sec

                          72℃40sec

④第三循环阶段(10个循环)：94℃30sec

                          58℃30sec

                          72℃40sec

⑤第三循环阶段(15个循环)：94℃30sec

                          62℃40sec

⑥结束阶段：              72℃5min

                          4℃保温

(4)杂交检测过程

杂交反应使用美国Roch公司地高辛检测试剂盒；

1)每个寡核苷酸微阵列浸入600μL杂交液(Roch公司)中50℃预杂交45min；

2)将地高辛标记的PCR扩增产物95℃变性10min然后淬火；

3)将50μL变性的PCR产物加入到600μL新换的杂交液(Roch公司)中，加入预杂交完的尼龙膜50℃晃动杂交1小时；

4)杂交完成后将膜冷却，室温下分别用2×SSC(+0.1％SDS)，0.5×SSC(+0.1％SDS)和洗涤缓冲液(Roch公司)按顺序各洗涤2min；

5)用封闭液封闭30min，加入酶联抗-地高辛抗体结合30min；

6)用洗涤缓冲液洗涤15min×2次，用检测缓冲液(Roch公司)平衡5min，加入含色原底物的显色液避光显色2小时后观察结果；

20×SSC：175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠，溶于800mL水，加入NaOH调节pH至7.0，定容1L；

2×SSC：将20×SSC用水稀释10倍；

0.5×SSC：将20×SSC用水稀释40倍。

3.一种检测海水中病原菌污染的寡核苷酸微阵列技术在检测其它海水水域中病原菌污染的应用。