[发明专利]一种通过诱变提高热带假丝酵母菌对镉的耐受性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过微生物诱变手段提高微生物对镉的耐受性的方法。

技术背景

镉(Cd)是生物毒性极强的重金属元素，与Pb、Cr、As和Hg合称为“五毒”，位列第二。近年来，现代工业的发展以及镉在冶炼、化工、造纸和电子工业等方面的广泛应用，使得Cd污染日趋严重。因此，如何修复环境中的镉污染，成为国内外研究的热点。目前，关于微生物修复镉污染的研究主要集中于对耐镉微生物的选择策略上。传统的耐镉微生物的筛选主要是采用“驯化”的方法，许多研究表明，在起始阶段经过“驯化”的微生物对镉能表现出较好的耐性，而在后期这种耐性却几乎消失。利用亚硝酸诱变对微生物进行诱变处理，是简单有效的诱变育种技术。国内外主要是利用亚硝酸诱变育种技术来获得大量高产的工业微生物菌株，但是利用该诱变技术来选育高效耐镉微生物的研究较少。

本发明的目的旨在提供一种通过微生物诱变手段提高微生物对镉的耐受性，以修复环境中镉污染的新方法。

发明内容

针对目前选择高效耐镉微生物技术中存在的问题，本发明提供一种通过诱变手段提高热带假丝酵母菌对镉的耐受性，从而修复环境中镉污染的方法。

本发明的一种通过亚硝酸诱变提高热带假丝酵母菌对镉的耐受性的方法，其包括以下步骤：

(1)首先将热带假丝酵母菌接种于葡萄糖蛋白胨液体培养基(YEPD)斜面，培养至处于对数生长期中段。取5mL菌悬液于离心管中，加入β-巯基乙醇-PB溶液和0.06mol/LEDTA溶液预处理。加入2％的蜗牛酶-高渗缓冲液悬浮，在28-30℃下，低速振荡恒温水解60-90min，定时取样镜检观察，当大部分细胞转化成球形的原生质体时，在3500r/min下离心约10min，弃去上清液，终止酶解，用高渗缓冲液洗涤2次，重新将原生质体悬浮于高渗缓冲液中。

(2)对步骤(1)中所制备的菌悬液3mL(10⁶cells/mL)置于直径7cm的平底培养皿中，进行亚硝酸诱变：于终浓度为0.025mol/L的亚硝酸溶液处理10min，对诱变后的活菌落进行筛选，获得对镉具耐受性的突变酵母菌。

(3)对步骤(2)诱变后的突变菌株进行筛选的方法为浓度梯度平板初筛和摇瓶发酵复筛相结合的两步筛选法。

步骤(1)的每升培养基以及步骤(3)的摇瓶发酵培养基成分为，葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏10g，pH 7.0。步骤(3)的浓度梯度平板培养基成分为，每升含有葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏10g，琼脂20g，pH 7.0。

步骤(2)的亚硝酸诱变结束后，加入0.07mol/L、pH 8.6的磷酸氢二钠溶液20mL，使pH值下降至6.8左右，以终止诱变反应。

步骤(3)的浓度梯度平板初筛和摇瓶发酵复筛的培养基中含镉浓度0.09mmol/L。

本发明的优点：

本发明通过亚硝酸诱变、两次筛选，得到对高浓度镉充分耐受的突变菌C44，其对镉的耐受浓度达到0.8mmol/L，是出发菌热带假丝酵母菌的耐镉浓度的10倍。通过本方法，提高了热带假丝酵母菌对镉的耐受性。

具体实施方式

出发菌热带假丝酵母菌难以耐受高浓度的镉。将出发菌亚硝酸诱变后会形成耐镉能力不同的酵母菌突变库，其中很可能含有少量对镉具有高耐受能力的菌株，关键是将这部分在突变库中占极少比例的镉的耐受型突变酵母菌从大量无义突变中筛选出来，如果镉耐受型突变酵母菌确实在突变库中存在，将突变库接入高浓度镉的培养基后，镉耐受型突变酵母菌就会生长，而大量无义突变酵母菌则死亡，从而诱变并筛选得到镉耐受型突变酵母菌。

以下通过实施例进一步对本发明进行描述：

实施例1：