[发明专利]一种葡萄糖探针及其制备方法和利用这种葡萄糖探针的糖芯片及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及糖芯片领域，更具体地讲，涉及一种葡萄糖探针及其制备方法和利用葡萄糖探针的糖芯片。

背景技术

糖结合蛋白具有重要的生物学功能，其表现在细胞间的通讯和识别，细胞与病原微生物的相互作用，细胞内蛋白的运输，蛋白间的相互作用，蛋白与受体的特异性结合等方面。生物芯片技术的三个探索方向即是基因芯片、蛋白质生物芯片及糖生物芯片。糖生物芯片的优越性在于：其一，生物活性稳定。糖生物芯片可在室温条件下长期保存生物活性不变。其二，应用范围广泛。把糖生物芯片技术应用于医学临床上，可对多种传染性与非传染性疾病同时进行快速诊断。因为所有的细胞表面都有含糖物质，这些糖化分子在细胞分子的识别过程中起着重要的作用。例如，血型的测定，人体免疫细胞对微生物病原体和某些肿瘤的识别等。

糖芯片作为近年来快速发展起来的一种生物技术，是在基因芯片和蛋白质芯片研究基础上相应诞生的，其基本原理也与基因芯片和蛋白质芯片相似，即将多个不同结构的糖分子通过共价或非共价作用固定于经化学修饰的基板上，进而对糖蛋白等待测样品或糖分子本身进行测试、分析。而在糖芯片制备中，糖探针的合成和固定是最重要的一步。

关于糖探针的制备方法，目前常见的方法根据化学作用的原理不同主要可分为三种：Cu(I)催化的叠氮与炔烃的反应[Huang C Y，Thayer D A，Chang A Y，et al.P.Natl.Acad.Sci.USA.，2006，103(1)：15-20]：Huang等用可编程一锅法合成了胸腺癌细胞和卵巢癌细胞表面的六糖抗原Globo H以及多种去顶端衍生物后，再用叠氮基团活化这些寡糖。然后在Cu(I)的催化下，炔基和叠氮基发生1，3-偶极成环加成反应，从而将制得糖探针。Diels-Alder成环加成反应[Sun X L，Stabler C L，Cazalis C S，et al.Bioconjugate Chem.，2006，17(1)：52-57]：Sun等开发了连续使用Diels-Alder成环加成反应和Click反应的糖探针合成工艺。马来酰亚胺与环戊二烯进行的Diels-Alder成环加成反应被用来作为糖探针的合成反应。逆Michael加成反应[Park S，Lee M R，Pyo S J.J.Am.Chem.Soc.，2004，126：4812-4819]：Park等报道了将玻璃片表面用巯基修饰后，通过逆Michael加成反应将马来酰亚胺基团连接到单糖上制得糖探针分子。

但在以上制备方法中，由于所值得的糖探针都存在反应基团活性不够的缺点，因此对后面糖芯片制备过程中的糖探针和基板的偶联存在较大的不利影响，影响了糖芯片实用性，所以在糖芯片的制备过程中糖探针的活性是急需考虑的一个问题，为此，科学家尝试了不同的合成方法来提高所合成糖探针的活性。同时采用物理吸附法制备糖芯片，固定在固相载体上的还原糖在实验过程中易脱落，影响结果的准确性。

发明内容

本发明旨在克服常见糖探针合成方法中所存在的活性不够和作用力不强的问题，并提高后续糖芯片的制备效率，提供一种葡萄糖探针及其制备方法和利用这种葡萄糖探针的糖芯片及其制备方法。

本发明的葡萄糖探针，分子为1-对氨基苯氧基葡萄糖，其中将伯氨基团通过苯氧基键接到葡萄糖分子的异头碳上。

本发明的制备葡萄糖探针方法，以葡萄糖单糖为原料，依次通过全乙酰化、溴代、硝基化、氨基化和脱乙酰化得到葡萄糖探针1-对氨基苯氧基葡萄糖，按照下述步骤制备：

(1)将20-25质量份葡萄糖、3-8质量份碘加入到1-5质量份醋酸酐中，形成悬浮溶液，室温反应至体系呈棕色透明；

(2)采用二氯甲烷对步骤(1)得到的反应体系进行稀释，然后在冰浴条件下，向其中加入3-8质量份溴化氢的冰醋酸溶液，其中溴化氢的体积分数为40％-50％，在室温下反应1-6h，洗涤，过滤，重结晶，得到乙酰溴代葡萄糖；

(3)先将1-5质量份的四丁基溴化铵，溶剂氯仿和水放入反应容器中，再将过量的对硝基苯酚和氢氧化钠加入反应容器中，然后加入20-30质量份乙酰溴代葡萄糖，搅拌，反应温度为35-60℃，反应时间4-8h，分离出有机相，洗涤，过滤，干燥，得到1-对硝基苯氧基-2，3，4，6-四-O-乙酰基葡萄糖；

(4)将5-15质量份1-对硝基苯氧基-2，3，4，6-四-O-乙酰基葡萄糖溶于乙醇中，加入过量铁粉，加热搅拌使其充分溶解，向体系中滴加1-5质量份盐酸，60-80℃加热回流3-8h，抽滤，得到黑色的滤液，脱色，萃取，将得到的1-对氨基苯氧基-2，3，4，6-四乙酰化葡萄糖，干燥；