[发明专利]果蝇抗肿瘤活性蛋白rd-1的高效异源表达工艺

说明书

(一)技术领域：

本发明涉及利用微生物发酵法生产活性蛋白的技术，特别是一种利用重组基因工程菌生产抗肿瘤活性蛋白的生产工艺，生产的活性性蛋白可作为抗肿瘤药品及保健品的主要成分。

(二)背景技术：

蛋白质是构成生命的物质基础，由20多种氨基酸组成。是机体细胞和组织重要组成部分。rd-1蛋白是一种通过功能筛选出的具有特殊生物活性的蛋白质，进入人体后主要发挥较强抗肿瘤、抗病毒等药理作用，通过已进行的实验预测该蛋白抗肿瘤的作用机理主要是通过抑制肿瘤细胞生长增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，可诱导系列抗肿瘤相关基因表达，涉及多个信号通路，与细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、抗炎免疫、抗原识别和提呈、抗病毒等。

(三)发明内容：

本发明的目的在于提供一种利用重组工程菌异源表达rd-1方法，它能克服果蝇不易饲养，提取工艺较复杂等现有技术中存在的问题，最大限度地降低成本，简化工艺，节能减排提，并能保持该蛋白的生物活性。

本发明的技术方案：果蝇抗肿瘤活性蛋白rd-1的高效异源表达工艺其特征在于它是通过下述步骤实现的：

(1)通过亲和层析方法提取rd-1蛋白并对N端和C端测序；

(2)根据测序结果设计并合成简并引物或核酸探针；

(3)采用SMART方法构建果蝇蛹cDNA文库；

(4)通过PCR方法或核酸杂交方法从果蝇蛹cDNA文库获得rd-1蛋白全基因；

(5)将rd-1基因和表达载体连接构建重组表达载体；

(6)将重组表达载体转入毕赤酵母进行异源表达；

(7)对重组比赤脚酵母进行发酵条件优化以期得到高水平的表达。

上述步骤(7)得到的发酵液上清离心取上清，并进行凝胶柱分离，去除发酵液中少量杂蛋白，最终通过冷冻干燥技术制成rd-1蛋白冻干粉。

发酵产rd-1蛋白，外观为白色粉末状，该蛋白理化性质为：球蛋白，直径8nm，带糖链，有beta 1，4糖苷键特异性并可被Schiff’s试剂染色。分子量：45kDa。结构：已有N端C端序列已测，没有4级结构。等电点：6.2、温度：65度以上失活、pH：4-8内稳定、金属离子：Fe³⁺and Mn²⁺在浓度3-12nM时候会使其失活，其他没有影响。

本发明的优越性在于：1、用本方法生产rd-1蛋白生产效率较高；2、该重组酵母菌发酵产rd-1蛋白为分泌性蛋白，切毕赤酵母自身分泌蛋白种类较少利于后期的纯化；3、能够保证rd-1蛋白的抗肿瘤生物活性4、和生物提取法相比降低生产成本，简化了纯化工艺，便于大规模生产及推广；5、本方法获得rd-1蛋白具有较高的抗肿瘤生物活性毒副作用小可作为抗肿瘤药物及保健品的主要成分。

(四)具体实施方式：

实施例1：果蝇抗肿瘤活性蛋白rd-1的高效异源表达工艺其特征在于它是通过下述步骤实现的：

(1)通过SepharoseCL-4B亲和层析柱，并运用0.2M D-半乳糖进行洗脱提取rd-1蛋白并对N端和C端测序；

(2)根据测序结果设计并合成简并引物Degenerate primer R和Degenerate primer F；

(3)采用SMART方法构建果蝇蛹cDNA文库；

(4)通过PCR法从果蝇蛹cDNA文库中获得rd-1蛋白全基因；

(5)将rd-1基因和表达载体连接构建重组表达载体；

(6)将重组表达载体转入毕赤酵母进行异源表达；

(7)对重组比赤脚酵母进行发酵条件优化以期得到高水平的表达，确定最优发酵条件为甘油添加量为4％，YNB添加量为1.25％，培养基pH6.0，甲醇诱导浓度1％，发酵时间84h。

上述步骤(7)得到的发酵液上清离心取上清，并进行凝胶柱分离，去除发酵液中少量杂蛋白，最终通过冷冻干燥技术制成rd-1蛋白冻干粉。

发酵产rd-1蛋白，其特征是：白色无味粉末。

实施例2：果蝇抗肿瘤活性蛋白rd-1的高效异源表达工艺其特征在于它是通过下述步骤实现的：

(1)通过SepharoseCL-4B亲和层析柱，并运用0.2M D-半乳糖进行洗脱提取rd-1蛋白并对N端和C端测序：

(2)根据测序结果设计并合成核酸探针DNA probe 1；

(3)采用SMART方法构建果蝇蛹cDNA文库；

(4)通过Southern blot技术从果蝇蛹cDNA文库中获得rd-1蛋白全基因；