[发明专利]乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种乙型肝炎病毒感染模型的构建，特别是涉及一种人胎肝干细胞用于抗HBV药物筛选的的乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法及应用。

背景技术

众所周知，乙型肝炎病毒(HBV)是引起肝脏疾病的最主要原因之一，全球大约有3.5亿人是慢性HBV携带者，严重的可导致肝硬化、原发性肝癌。病毒性乙型肝炎流行面广，传染性强，是世界上最常见的感染性疾病之一，人一旦被乙肝病毒感染，肝脏就会发生炎性病变，肝细胞受损，对人体造成极大的危害，因此研究HBV的发病机制及其防治方法具有重要的意义。

研究HBV生物学特性、乙型肝炎发病机制、体外抗HBV药物筛选及其防治方法的重要环节之一就是要建立方便有效的HBV体内外感染模型。现在用于研究HBV的动物感染体内模型，主要有灵长类、树鼩、鸭和应用最多的转基因小鼠模型及人鼠嵌合肝模型；建立模型的细胞包括成人肝细胞、胎肝细胞、HepRG细胞系及以HepG-2为基础的转基因细胞。动物模型虽然能模拟体内HBV感染过程，但是仍存在HBV复制表达水平不高，种间差异及免疫缺陷等问题。而建立的细胞感染体外模型，由于均存在不同程度的局限性，因而仍然没有合适理想的模型，如成人肝细胞是一类终末分化的细胞，不能传代培养，且在肝细胞铺板后，成熟肝细胞的功能如白蛋白产生能力下降、失去典型多角形态，对病毒敏感性也逐渐下降，因此限制其实际应用；胎肝细胞也终究因为不能传代培养而在应用中受到制约；HepRG细胞系模型不仅不能获得完整的HBV颗粒，而且难以去除添加物对HBV感染过程的可能影响；而在目前应用最广的以HepG-2为基础的HepG2.2.15转基因细胞中，由于HBV整合在宿主细胞染色体上且不能被清除，因而其复制方式与自然感染不同，细胞培养中不产生cccDNA(复制中间体)，病毒复制水平低，另外，HBV与转染肝癌细胞长期稳定的整合状态难以用于研究细胞的转化机制。

此外，人们还探讨了HBV感染的非肝源性细胞，并且，越来越多的研究表明，HBV不仅感染肝源性细胞，也可以感染其它如骨髓干细胞、内皮祖细胞、胎盘滋养层细胞等具干细胞特性的细胞，但是，由于HBV不能或很难在这些细胞中复制繁殖，且这些细胞为非肝脏源细胞，HBV感染机制可能不同，因此仍然不能用于建立理想的细胞感染模型。

胎肝干细胞(hepatic stem cell，HSC)是胎儿体内存在的一种具有自我增殖能力和多向分化潜能的肝源性干细胞，既可以向胆管细胞分化，又可向肝细胞分化。它并非特指某一种类的细胞，而是由与肝脏胚胎发育及再生有关的各类具有干细胞特性的细胞组成，如肝脏在胚胎期出现的胎肝干细胞及成肝细胞(哺乳动物胚胎发育早期阶段肝内的干细胞，它同时表达肝细胞表型和胆管细胞表型，后两者又可进一步分化成为成熟肝细胞和胆管细胞)、成年肝脏内存在的兼性肝细胞及其子代细胞卵圆细胞等。肝干细胞作为治疗肝脏相关疾病的一种细胞来源，对肝的细胞移植，组织工程和基因治疗等有很重要的作用。

截至目前，尚未见利用人胎肝干细胞构建HBV体外感染模型的报道。

发明内容：

本发明的主要目的在于克服以上不足而提供一种全新的利用人胎肝干细胞用于抗HBV药物筛选的乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法及应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：它包括人胎肝干细胞的分离培养、鉴定人胎肝干细胞、乙肝病毒血清感染细胞和验证乙肝病毒已感染细胞且病毒已繁殖，其特征在于：本发明是采用人胎肝干细胞用于抗乙型肝炎病毒药物筛选的乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法的步骤为分离培养人胎肝干细胞、免疫组化鉴定人胎肝干细胞、乙肝病毒血清感染人胎肝干细胞、验证乙肝病毒已感染人胎肝干细胞且病毒已繁殖：

I.分离培养人胎肝干细胞：

(1).胎肝干细胞的分离培养：将胶原酶原位灌注肝脏-剥离肝细胞悬液-过滤-充分散开细胞-离心细胞悬液-弃掉上清液-沉淀的细胞用培养基悬浮-将细胞放入离心管中-置于冰上沉淀-利用肝干细胞黏附作用使细胞沉淀-去除细胞悬液-离心沉淀细胞-细胞用PBS液悬浮-用PBS液将Percoll按体积分数配成90％、70％和50％3种浓度梯度-离心并吸取位于不同Percoll之间细胞层悬浮沉淀的细胞-接种于塑料培养瓶中，培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液-并在37℃、5％CO₂孵箱中培养过夜，新分离的细胞用0.25％台盼蓝染色观察细胞活力；