[发明专利]一种厌氧反硝化细菌的快速分离方法及所用到的特异性引物

权利要求书

1.一种厌氧反硝化细菌的快速分离方法，其特征在于厌氧反硝化细菌的快速分离方法按以下步骤实现：一、采用DNA抽提试剂盒提取样品中微生物的DNA，然后采用特异性引物对DNA进行PCR扩增，选择含有厌氧反硝化细菌的样品，然后接种于厌氧菌液态培养基中，采用Hungate厌氧操作技术进行厌氧反硝化细菌的分离培养，然后对分离培养得到的菌进行检验，初筛出厌氧反硝化细菌；二、将初筛得到的厌氧反硝化细菌接种于厌氧菌固体培养基中，制成滚管进行厌氧反硝化细菌的纯化培养至长出菌落；三、在厌氧工作箱中挑取单菌落接种于厌氧菌液体培养基中进行富集培养7～14天得菌液，然后采用特异性引物对菌液中细菌的DNA进行PCR扩增，复筛出厌氧反硝化细菌；四、对复筛得到的厌氧反硝化细菌的菌液，依次进行分离培养、纯化培养和富集培养，然后对富集培养的菌液进行镜检和革兰氏染色，再采用特异性引物对菌液中细菌的DNA进行PCR扩增，去除重复菌株，然后重复操作分离培养和纯化培养至获得纯菌株，即完成厌氧反硝化细菌的快速分离；其中步骤一中PCR扩增程序为94℃预热5min、94℃变性30s、55.9℃复性45s、72℃延伸90s、循环30次和72℃延伸10min；特异性引物为上游特异性引物5’-GC[T/C][C/T]ACCAAG[G/C]CGACGATC-3’，下游特异性引物5’-ACCAGGGTATCTAATCCTG-3’；步骤一中PCR扩增的反应体系如下：

10×PCR Buffer              2μL

dNTPs 0.3mmol/L             2μL

上游引物0.1μmol/L          1μL

下游引物0.1μmol/L          1μL

rTaq E 0.3U/μL             0.3μL

DNA样品2μg/L               2μL

补足dH₂O                    至20μL；

步骤一中厌氧菌液态培养基由2.0g的KNO₃、2.0g的NaNO₃，0.03g的MgSO₄·7H₂O、0.5g的K₂HPO₄、10g的酒石酸钾钠、1.0g的KH₂PO₄、0.5g的FeCl₂·6H₂O、0.2g的CaCl₂·2H₂O和1750mL的蒸馏水组成，pH＝7.5；步骤二中厌氧菌固体培养基由2.0g的KNO₃、2.0g的NaNO₃、0.03g的MgSO₄·7H₂O、0.5g的K₂HPO₄、10g的酒石酸钾钠、1.0g的KH₂PO₄、0.5g的FeCl₂·6H₂O、0.2g的CaCl₂·2H₂O、12g琼脂粉和1750mL的蒸馏水组成，pH＝7.5；步骤一和步骤三中厌氧菌液态培养基成分相同；步骤三和步骤四中采用特异性引物对菌液中细菌的DNA进行PCR扩增，采用的方法与步骤一中的相同。

2.根据权利要求1所述的一种厌氧反硝化细菌的快速分离方法，其特征在于步骤二中厌氧菌固体培养基的成分配置好后放入到电磁锅中，煮沸后加入L-半胱氨酸0.5g和质量浓度为0.2％的刃天青溶液指示剂此时有氧气存在，培养基的颜色为粉红色，不断加热煮沸，盖上锅盖，通入质量纯度为99.99％的氮气驱氧30～40min，直至培养基由粉红色变成无色，然后厌氧管分装，在121℃的条件下灭菌20min。

3.根据权利要求2所述的一种厌氧反硝化细菌的快速分离方法，其特征在于步骤三中富集培养8～12天。

4.根据权利要求2所述的一种厌氧反硝化细菌的快速分离方法，其特征在于步骤三中富集培养10天。