[发明专利]乳制品中活双歧杆菌检测试剂盒

权利要求书

1.一种乳制品中活双歧杆菌检测试剂盒，其组成包括：添加特异性引物和分子信标探针的PCR反应液、Taq DNA聚合酶、EMA溶液、ROX参比染料，其特征是：其体积比为：添加特异性引物和分子信标探针的PCR反应液3900ul、Taq DNA聚合酶100ul、EMA溶液300ul、ROX参比染料300ul。

2.根据权利要求1所述的乳制品中活双歧杆菌检测试剂盒，其特征是：所述的特异性引物包括正向引物和反向引物，所述的正向引物为Bif-F，长度为19bp，序列为5′-TCTGGCTCAGGATGAACGC-3′，结合位点落在长双歧杆菌16SrDNA序列的20～38bp号位置；所述的反向引物为Bif-R，长度为20bp，序列为5′-CACCGTTACACCGGGAATTC-3′，结合位点落在长双歧杆菌16S rDNA序列的655～674bp号位置。

3.根据权利要求1或2所述的乳制品中活双歧杆菌检测试剂盒，其特征是：所述的分子信标探针序列为：5′-FAM-CCAGGCATCCGGCATTACC ACCCGTCCTGG-3′-DABCYL，其中5′端标记荧光基团FAM，6-羟基荧光素，荧光发射峰值在518nm处，3′端标记淬灭基团DABCYL，4-4′-恶烷氨基苯偶氮苯甲酸，荧光发射峰值在491nm处。

4.根据权利要求1或2所述的乳制品中活双歧杆菌检测试剂盒，其特征是：所述的PCR反应液是按照上游引物浓度为10μmol/L、下游引物浓度为10μmol/L，分子信标探针浓度为5μmol/L；将上游引物、下游引物各200μL、分子信标探针200μL与不含Mg²⁺10×PCR Buffer250μL、Mg²⁺250μL、dNTP混合物200μL，在无菌条件下加入到无菌的棕色的1.5mL的离心管中充分混合均匀，所述的Taq DNA聚合酶浓度为2.5U/μL，所述的EMA溶液，是在避光的条件下将EMA粉末溶于DMF溶液中，终浓度为1μg/μL，所述的ROX参比染料浓度为0.02mol/L。

5.一种乳制品中活双歧杆菌检测的方法，首先取样，其特征是：取样后，应用所述的试剂盒中的EMA溶液对样品进行EMA处理，提取样品的DNA，再应用试剂盒中的反应液进行实时PCR检测，计算双歧杆菌的含量。

6.根据权利要求5所述的乳制品中活双歧杆菌检测的方法，其特征是：所述的取样是在无菌操作将充分混匀的含双歧杆菌制品的样品放入含有PBS缓冲液的灭菌锥形瓶内做成1∶10的均匀稀释液，室温静置水合30min。

7.根据权利要求5或6所述的乳制品中活双歧杆菌检测的方法，其特征是：所述的EMA处理样品是取混合均匀的含双歧杆菌制品的样品稀释液，加入浓度为1μg/μL EMA溶液，充分混匀，避光反应5min，采用650W的卤素灯照射2min，样品距光源20cm，操作在冰上进行，每个样品做两个平行。

8.根据权利要求5或6所述的乳制品中活双歧杆菌检测的方法，其特征是：所述的DNA提取过程是：取1mL经EMA处理后的样品，加入150μL 18％(w/v)的柠檬酸钠和100μL 4％(w/v)氢氧化钠，10000r/min离心2min，收集菌体细胞，加入1mL PBS缓冲液吹打沉淀，于11500g离心2min，弃上清，再加入1mL去离子水吹打沉淀，于11500g离心2min，弃上清，再按照细菌基因组提取试剂盒进行操作。

9.根据权利要求5或6所述的乳制品中活双歧杆菌检测的方法，其特征是：所述的实时PCR检测的方法是：取PCR反应液26μL、ROX参比染料2μL、Taq DNA聚合酶0.5μL、模板DNA 5μL，加入去离子水补至50μL，混合均匀，进行实时PCR检测，荧光信号采集的退火温度为40℃，循环参数为：94℃×3min→94℃×30s→40℃×35s→59℃×30s→72℃×1min，循环数为40。