[发明专利]检测牛病毒性腹泻病毒的方法逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的制备及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及反应试剂盒的制备及其使用方法。 

背景技术

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)又称牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus，BVD-MDV)，为单股正链RNA病毒；牛接触性传染，症状主要表现为腹泻，急、慢性粘膜病，持续性感染与免疫耐受，免疫抑制，母畜流产、死胎和畸胎等；该病主要发生于牛，还可感染猪、羊、鹿、骆驼及其它野生反刍动物。BVDV具有特征性的临床症状较少，在实际生产中常常不易被诊断，加之本病的病死率不高，未能引起人们的足够重视而忽视本病的存在，因此各牛场牛群缺乏系统的监测防制措施。BVDV对部分牛形成持续性感染，可严重影响牛的繁殖和生产，给养牛业造成了严重的经济损失，阻碍了我国牛养殖业的健康发展，因此对牛群进行普查，检测其感染情况，淘汰感染个体，成为本病防制的重要环节。所应用的检测手段必须能够有效的区分感染个体和非感染个体。 

目前，普通的血清学检测方法不但无法区分自然感染个体和疫苗免疫个体，同时也无法检出因长期持续性感染而无抗体产生的个体，传统的病原学分离操作手段复杂、耗时无法应用于大规模筛查检测。应用RT-PCR检测牛病毒性腹泻病毒核酸灵敏度差，较难检测持续性感染牛只。应用Real-time PCR检测，虽然灵敏度较高，但是Real-time PCR检测成本昂贵、需要专业设备及专业人员参与检测，不适于现阶段中国畜牧业发展状况，较难大规模推广使用。 

发明内容

本发明目的是为了解决现有检测牛病毒性腹泻病毒的方法存在成本昂贵，需要专业设备及专业人员参与检测且不适于现阶段中国畜牧业发展状况的问题，而提供检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的制备及其使用方法。 

检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的制备方法 按以下步骤实现：一、从基因数据库中检索所有牛病毒性腹泻病毒的基因序列，通过Clustalw软件分析找出特异性的保守靶DNA序列，然后利用Primer Explorer 4软件设计6条引物；二、根据所得的6条引物配制逆转录环介导等温扩增反应液，即完成检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的制备；其中步骤一中保守靶DNA序列为：TGAGGGACAAATCCTCCTTAGCGAAGGCCGAAAAGAGGCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGCAAAACAAGGAGGGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGATGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTTGTGCGACAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAGCGGGGGTCGTTCAGGTGAAAACGGTTTAACCAACCGCTACGAATACAGCCTGATAGGGTGCTGCAGAGGCCCACTGTATCGCTACTAAAAATCTCTGCTGTACATGGCACATGGAGTTGATTACAAATG； 

步骤一中6条引物分别为： 

名称                    序列 

F3    5’-TGCCCTTAGTAGGACTAGCA-3’ 

B3    5’-AGCACCCTATCAGGCTGTA-3’ 

FIP   5’-CGAACCACTGACGACTACCCTGTTTTGGTAGCAACAGTGGTGAGTT-3’ 

BIP   5’-CAAGCCTCGAGATGCCACGTTTTTCCGTTTTCACCTGAACGACC-3’ 

FL    5’-AGGGCTTCAGCCATCCAACG-3’ 

BL    5’-CAGCACATCTTAACCTGAGCGG-3’； 

步骤二中逆转录环介导等温扩增反应液为每20μl反应液由1.9μl的水、2.5μl的10×ThermoPol反应缓冲液、0.1μl的1M硫酸镁、2μl的5M甜菜碱、4μl的10mM dNTP、1μl的20×SYBR GREEN I、1μl的5μM引物F3、1μl的5μM引物B3、1μl的20μM引物FL、1μl的20μM引物BL、1μl的40μM引物FIP、1μl的40μM引物BIP、1μl的8U/μlBstDNA聚合酶、0.5μl的40U/μl核糖核酸酶抑制剂和1μl的10U/μl AMV逆转录酶组成。