[发明专利]一种人胎盘组织液抗炎作用检测方法

权利要求书

1.人胎盘组织液抑制丝裂原刺激的hPBMC增殖以及分泌IFN-γ及TNF-α的作用的检测方法，其特征在于：其工艺步骤为：①人胎盘组织试验液的配制，②hPBMC制备，③人胎盘组织试验液与hPBMC共培养，④ELISA检测TNF-α及IFN-γ，⑤MTT检测hPBMC增殖，⑥结果分析；所述的人胎盘组织试验液的配制步骤为人胎盘组织原液及用RPMI1640完全培养液2倍、4倍、6倍的进行稀释，即得人胎盘组织试验液；所述的hPBMC制备步骤，即在无菌条件下，预置10mlFicoll分离液于50ml离心管中；取正常成人供者血液20ml，以1:2的比例用平衡至室温的PBS将外周血稀释，将60ml稀释的外周血沿45度倾斜的管壁缓慢加至盛有30mlFicoll分离液的离心管中，在关闭Heraeus离心机机械制动功能前提下，2000rpm离心20min，小心收集界面单个核细胞层至50ml离心管中，加入PBS至20ml，1500rpm离心10min，洗涤2次，并作细胞计数，以RPMI1640+10%FBS+1%双抗重悬细胞至2×10⁶/ml；所述的人胎盘组织试验液与hPBMC共培养步骤，即50μlhPBMC和50μlPHA混合接种于96孔平底板，然后向其中加入100μl不同浓度的人胎盘组织试验液，每组设5个复孔；同时将空白对照组、阴性对照组和阳性对照组接种于96孔平底板，每组设5个复孔，将96孔培养板置于37℃，5%CO₂，饱和湿度的细胞培养箱中孵育72h；所述的空白对照组为50μlPHA与150μlRPMI1640完全培养液的混合物，所述的阴性对照组为50μlhPBMC与150μlRPMI1640完全培养液的混合物，所述的阳性对照组为50μlhPBMC、50μlPHA和100μlRPMI1640完全培养液的混合物；所述的ELISA检测TNF-α及IFN-γ步骤，即将经72h培养后的96孔板取出，1500rpm离心10min，吸取hPBMC细胞培养液上清置于0.5mlEP管中，稀释，分别用人IFN-γELISA试剂盒、人TNF-αELISA试剂盒检测IFN-γ及TNF-α含量；所述的MTT检测hPBMC增殖步骤，即从培养的hPBMC细胞每孔吸出20μl上清，加入20μlMTT，在细胞培养箱中继续培养4h，1500rpm离心10min，吸弃培养液上清后每孔加入150μlDMSO，微量振荡器振荡10min后用酶标仪于599nm检测。

2.根据权利要求1所述的人胎盘组织液抑制丝裂原刺激的hPBMC增殖以及分泌IFN-γ及TNF-α的作用的检测方法，其特征在于：所述的结果分析步骤，即采用SPSS13.0软件、GraphPadPrism5Demo软件进行统计学分析。