[发明专利]一种具有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种具有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质及应用。

背景技术

抗生素能够抑制或杀伤病原微生物，其应用对保障人类健康发挥了重要的作用。然而，由于抗生素的过度使用，增加了细菌的耐药性，导致抗生素的疗效下降。抗菌肽是生物中存在的具有抗菌活性的小分子多肽，它们是生物抵御病原微生物入侵的一道重要防线。抗菌肽可以作用于病原菌的细胞膜，使膜去极化或者形成“孔洞”，造成细胞内含物外流或者肽分子进入细胞内部与靶标作用，进而杀死细菌。由于抗菌肽可作用于细菌的多个位点，所以不易引起细菌的抗性，并且抗菌谱宽。因此，抗菌肽有可能成为新的抗菌药物。另外，除临床应用外，抗菌肽的应用领域还包括：用于食品防腐剂、饲料添加剂、化妆品领域以及提高植物抗病性等。

第一个报道的抗菌肽是天蚕素(cecropins)(Boman et al，1974)，随后，蛙皮素(Magainins)、蜂毒素(Melitins)、防御素(Defensins)等先后被发现(石强等，2000)。三十多年来，人们鉴别获得了上千个抗菌肽，所采用的主要筛选策略大致可分为如下几种：一是基于分离技术的筛选策略；二是利用差异显示技术筛选抗菌肽编码基因；三是基于同源序列筛选抗菌肽编码基因；四是用生物信息学方法鉴别抗菌肽；五是高通量筛选鉴别抗菌肽的策略(王海娇等，2007)。2006年，成雄鹰等发展了一种简便的高通量方法，该方法基于各种cDNA表达文库或人工合成的oligo表达文库，将支持物(如微孔滤膜)放在含有合适抗性的固体培养基上，表达文库按一定的密度涂在支持物上，待菌落长到一定大小后，将支持物转到含有诱导物的培养基上继续培养，然后染色；鉴别克隆或细胞的活性。如果诱导表达产物对宿主有害，使宿主活性降低或死亡，则死体被染料染色后着色。

脱水素(Dehydrin)最早由Close等人发现，这是一类可被外源ABA、干旱及盐分诱导的蛋白质，这些蛋白质具有很强的亲水性(Close et al，1989)。此后，人们陆续报道了不同植物中的脱水素质白质。按Dure对逆激蛋白质的分类，脱水素蛋白质属于LEA D-II家族，分子量从9kD到200kD不等，其结构中一般含有以下三个保守片段：Y、K和S片段(Dure et al.1993)。其中，K片段富含赖氨酸，为所有Dehydrin家族蛋白质所共有，其保守序列为EKKGIMDKIKEKLPG(Close et al.1997)。但到目前为止，还没有脱水素蛋白质能够抑制细菌生长的报道。

利用高通量筛选体系，本发明人从水稻、青蛙等表达文库中鉴别获得了几十个对大肠杆菌生长有抑制作用的克隆，与未诱导培养基中细胞的生长相情况比较，细胞生长程度明显下降。为了进一步验证水稻脱水素蛋白质的抑菌功能，本发明利用大肠杆菌体系表达了脱水素蛋白质及其片段，体外合成了脱水素蛋白质的片段，并进行了水稻脱水素蛋白质的抑菌活性实验。

发明内容

本发明的目的是提供一种有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质及应用于抑菌实践。

本发明的第一个目的是提供一种具有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质(英文名称为Dehydrin)，来源于水稻(Oryzae Sativa L.)是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑菌活性的蛋白质；

3)序列表中的SEQ ID NO：1的15个氨基酸以上片段；

上述具有抑菌活性的水稻脱水素蛋白质(Dehydrin)的编码基因，也属于本发明的保护范围，其核苷酸序列符合下述特征之一：

1)序列表中SEQ ID No：2的核苷酸序列；

2)与序列表中SEQ ID No：2的DNA序列有85％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

3)序列表中SEQ ID No：2的DNA序列中长于45bp的片段，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

本发明的另一个目的是水稻脱水素蛋白质在抑菌中的应用。

实验证明，所述的水稻脱水素蛋白质或其片段在细菌中表达后，其细菌裂解液或纯化蛋白质能够抑制短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、黄八叠球菌及金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性细菌的生长，同时，体外合成的所述蛋白质片段能够抑制短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、黄八叠球菌及金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性细菌的生长。