[发明专利]一种外层经亲水聚合物修饰的脂质体药物的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种脂质体的制备方法，具体地说，涉及一种外层经亲水聚合物修饰的脂质体的制备方法，及其在制备治疗肿瘤疾病的药物中的用途。

背景技术

脂质体可以作为许多药物的载体。作为抗肿瘤药物(尤其是化疗药物)的载体，它可以减少药物在正常组织的分布，增加药物在肿瘤组织的蓄积量，从而改善药物的治疗指数。

传统的脂质体在体内很容易被免疫系统识别和吞噬，因此脂质体可能还没有到达靶区，就已经被机体清除掉了而无法发挥其靶向作用。长循环脂质体又称隐形脂质体，能够阻止巨噬细胞对脂质体的识别和摄取，从而延长脂质体在血中的循环时间，进而借助EPR效应富集到肿瘤组织中，最终实现肿瘤的被动靶向。此外，长循环脂质体由于表面覆盖了聚乙二醇亲水保护层，能够避免脂质体聚集，可以提高其在储存期内的稳定性。所以长循环脂质体技术一经发明，即成为国际抗肿瘤脂质体制剂研究的热点和化疗药物剂型的最佳选择。

制备长循环脂质体最常用的磷脂修饰物为甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇铵(mPEG2000-DSPE)，传统的mPEG-DSPE加入方式是在脂质体形成初期将其与磷脂和胆固醇一起加入，这种操作的结果就是在磷脂双分子层形成后，mPEG-DSPE均匀分布在磷脂双层膜的内、外表面。该方法适用于大多数药物，如盐酸多柔比星，以此技术制备的长循环脂质体已于1995年在美国成功上市，商品名为楷菜。

但是我们在制备长春瑞滨长循环脂质体的过程中发现，mPEG-DSPE的加入，会阻碍长春瑞滨的装载，当药脂比较高时，mPEG-DSPE对长春瑞滨载药影响更为显著，包封率不足10％。分析认为有两个原因：①在传统的主动载药技术中，药物通过与内水相阴离子(如硫酸根、柠檬酸根)结合形成沉淀，获得较高的包封率，而弱碱性药物分子，如长春碱类和拓扑异构酶抑制剂类化合物，与脂质体内水相阴离子形成沉淀能力差，因而药物在内水相中的滞留能力差，影响药物的装载；②带正电荷的长春瑞滨在阴离子梯度及pH梯度等载药动力驱使下进行跨膜载药时，与嵌在磷脂双层膜外表面上大量的带负电荷的mPEG-DSPE优先结合，载药初期时，载药动力足以克服药物与mPEG-DSPE的结合力，使其能够跨膜进入脂质体内水相；但是随着药物的装载，载药动力逐渐减弱，剩余的药物便结合在mPEG-DSPE上，不能进入脂质体内水相，从而降低了载药的效率。并且分布在磷脂双层膜内表面的mPEG-DSPE会通过电荷引力与已经载入内水相的药物结合，进而促使药物从脂质体中渗漏出来，而达不到缓释、靶向的目的。

由以上分析可知，mPEG-DSPE的加入既影响了药物的装载，还促进了药物在体内的渗漏，其作用弊大于利。但是若不加又无法延长脂质体在血液中的循环时间，无法达到缓释增效的目的。所以如何消除由mPEG-DSPE的加入带来的负面作用成为研究的难点和重点。仔细分析mPEG-DSPE的作用机理，其实真正起到屏蔽吞噬、防止聚集作用的只是覆盖在脂质体外层的mPEG-DSPE，而内层的部分根本未起作用，反而是促进药物渗漏的原因，所以如何制备得到单独外层含有mPEG-DSPE的脂质体成为解决问题的关键。就此问题本专利的研究人员受到了一些前人研究工作的启发，下面详述。

加拿大的Allen等人在进行配位靶向脂质体的研究中发明了后插入技术。传统的配位靶向脂质体的制备方法是先将单克隆抗体，如anti-CD 19，连接到mPEG2000-DSPE上，然后将mPEG2000-DSPE-单抗与磷脂、胆固醇一起溶解于有机溶剂中，经过水化、透析、载药等步骤制备得到含药脂质体。该方法的缺陷在于脂质体的制备过程中有多个加热步骤，这会造成部分抗体的失活和抗体的浪费，进而影响脂质体的配位靶向性。而后插入技术则很好的解决了这个问题。该方法是先制备含有带有连接位点的mPEG2000-DSPE(如Mal-PEG2000-DSPE)的长循环脂质体，然后将其与PEG-抗体反应，则抗体与mPEG2000-DSPE相连，分布在磷脂双层的外表面，从而产生配位靶向作用。动物实验证明用后插入法制备得到的阿霉素配位靶向脂质体与传统方法制备得到的脂质体具有相同疗效和细胞毒性，但是操作简便，灵活。(In vitro and in vivo comparison of immunoliposomesmade by conventional coupling techniques with those made by a newpost-insertion approach.Biochimica et biophysica acta 1513(2001).)