[发明专利]一种抗猪链球菌细菌素及其生产方法与专用菌株

说明书

本发明所属的技术领域

本发明提供一株有自主知识产权的屎肠球菌，及该屎肠球菌产生的细菌素、细菌素的制备方法与应用， 属于生物技术领域。

发明的背景技术

随着对微生物活性代谢产物研究的进行，乳酸菌及其产生的细菌素成为研究的热点。某些乳酸菌细菌 素能抑制常见的腐败菌和一些病原菌。细菌素是菌体通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌生物活性的 多肽，具有较好的选择性杀菌效果，对热、酸等稳定性好，经蛋白酶作用而降解，不会在体内残留，具有 较高的安全性，因而得到了较为广泛的研究应用。

其中，肠球菌是乳酸细菌的一个属，为动物体内正常定居的微生物，其产生的细菌素在复杂的微生态 环境中扮演着非常重要的角色，对许多种属的微生物表现出强烈的抑菌活性，不同的肠球菌素抑菌谱各不 相同。在肠球菌素的研究中，有关屎肠菌素的报道最多。防治动物疾病是屎肠球菌及其产生细菌素的重要 应用方向。至今为止，纯化为均一物质并被深入研究的屎肠球菌素有enterocin A，P，B，L50A，L50B，I，Q，M， 从不同生境筛选的屎肠球菌及其产生的细菌素目前主要用来防治动物的大肠杆菌、沙门氏菌等的感染。应 用方法为：屎肠球菌作为益生菌制剂添加入饲料中，通过促进其生长的低聚糖等来使其定植于肠道中，发 挥其抗菌效果，以预防感染；屎肠球菌产生的细菌素纯品稀释到一定浓度后，以生理盐水或灭菌注射用水 稀释，肌肉注射，连用3-4 d来治疗猪的各种细菌性感染疾病。

猪链球菌病为一种常见的猪病，在我国其病原菌主要以马链球菌兽疫亚种为主。该病在猪群中以呼吸 道为主要传播途径，且可以通过伤口、消化道等途径传播，发病率和死亡率均较高。目前，全群预防在临床 上常用弱毒疫苗免疫和饲喂抗生素两种方法。由于致病性猪链球菌的血清型较多，故免疫预防常常不能起 到很好的效果；抗生素虽能够在一定程度上控制该病的流行，但容易引起猪胃肠道菌群失调，造成耐药菌 增多及肉制品药物残留等问题，因此，用可以强烈抑制病原菌的细菌素来代替传统治疗方法成为促进养猪 业健康发展的必然选择。

本发明所解决的问题

本发明的目的是针对我国目前没有可以安全有效防治猪链球菌病方法，猪链球菌病频频发生，为养猪 业带来了巨大的经济损失的现实，提供一株有自主知识产权的屎肠球菌，及该菌所产细菌素的制备方法及 应用。该细菌素对酸、热稳定，可以强烈抑制猪链球菌病的主要病原菌-马链球菌兽疫亚种，易被胰蛋白酶、 胃蛋白酶、蛋白酶K降解，提取方法简单易行，应用效果良好，为预防和治疗猪链球菌病提供了新的途径。

发明内容

本发明筛选出一株产细菌素屎肠球菌LPL420P06，已于2009年1月8日在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC 2856，所产细菌素具有抑制马链球菌兽疫亚种(该菌是 我国养猪业流行的猪链球菌病的主要病原菌)的活性。

本发明屎肠球菌LPL420P06的特征是：在MRS液体培养基中多呈对排列，细胞卵圆形，菌体大小为 0.6～2.0μm×0.6～2.5μm，不生芽孢，革兰氏阳性，兼性厌氧。在MRS固体培养基上呈现微小圆形，白色 突起、较厚、边缘圆整的菌落。可发酵糖类产酸。其接触酶阴性，不运动，在10℃、45℃，6.5％ NaCl，pH 值9.6均能生长，V-P反应、精氨酸双水解酶和马尿酸水解为阳性，具有Lancefield D群抗原，不能耐受 0.04％亚碲酸盐。

本发明还提供了抗猪链球菌细菌素产生菌的筛选方法及该菌产细菌素培养方法。

本发明之产抗猪链球菌细菌素菌株的定向筛选方法，从健康长白、大白未断奶仔猪的粪便中随机取样， 将所得单菌落点种于含马链球菌兽疫亚种(引起猪链球菌病的主要病原菌)的固体平板上进行初筛，37℃ 培养24h观察周围有抑菌圈的菌落即怀疑为细菌素产生菌。将初筛得到的菌株进行培养，得到发酵上清液， 排除干扰因素(有机酸如乳酸、过氧化氢及菌体细胞等)的干扰后仍有抑菌活性，而经蛋白酶的处理后无 抑菌活性上清液对应的菌株为产细菌素菌株。