[发明专利]棉花杂交种的DNA指纹纯度检测方法

权利要求书

1.一种棉花杂交种中棉所48种子纯度检测方法，其特征在于， 使用选自BNL1705的特征引物进行检测。

2.根据权利要求1所述中棉所48种子纯度检测方法，其特征在 于，包括DNA提取、使用选自BNL1705特征引物进行SSR-PCR扩增、 电泳和银染检测步骤。

3.根据权利要求2所述中棉所48种子纯度检测方法，其特征在 于，所述DNA提取包括以下步骤：将去壳棉种充分粉碎后，加入800μl SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴30min，间隔10min轻摇一次；加 入等体积800μl酚、氯仿和异戊醇的混合液，所述酚、氯仿和异戊醇 的体积比依次为25∶24∶1，混匀至不分层，10000rpm离心10min； 取上清，加入1μlRNase(10mg/ml)，37℃水浴30min；重复抽提一次后 离心取上清，加入0.7倍体积异丙醇，待DNA成团析出后，70％乙醇 洗涤DNA沉淀2次，加入200μlTE或ddH₂O充分溶解DNA，备用。

4.根据权利要求2所述中棉所48种子纯度检测方法，其特征在 于，所述SSR-PCR扩增反应体系，其中20μl反应液中包括：1.5mmol/L MgCl₂，0.1mmol/L dNTP，1×Buffer，0.3μmol/L SSR引物，1U Taq DNA聚合酶，2μl DNA模板；反应程序为：95℃预变性2min，一个循 环；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃ 延伸7min，一个循环；4℃保存待用。

5.根据权利要求2所述中棉所48种子纯度检测方法，其特征在 于，所述电泳步骤中，PCR扩增产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳，恒功率80W电泳1h。

6.根据权利要求2所述中棉所48种子纯度检测方法，所述银染 检测包括以下步骤：用10％乙醇和0.5％冰醋酸组成的固定液固定 10min；用双蒸水快速漂洗1次；用0.2％AgNO₃溶液染色5min；用双 蒸水快速漂洗1次；用3％NaOH和0.5％甲醛组成的显影液显影；用10％ 无水乙醇和0.5％冰醋酸组成的固定液定影。