[发明专利]与A-beta寡聚体特异性结合的基因工程单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明属基因工程抗体技术领域，具体涉及与A-beta寡聚体特异性结合的 基因工程单克隆抗体，本发明还涉及该单克隆抗体的制备方法以及含有该单克 隆抗体的药物组合物。

背景技术

研究表明阿兹海默病(Alzheimer’s Disease，简称AD)，俗称老年性痴呆 是由无毒性的β-淀粉样蛋白单体分子(β-Amyloid，A-beta 40/42以下简称A-beta， 也可写成Aβ)聚集形成具毒性作用的寡聚体引起的老年人主要以记忆力下降和 脑部形成老年斑为特征的神经退行性疾病(Selkoe等，Science 1997，275， 630-631；Koo等，PNAS 1996，9989-9990)。医学统计表明，我国和欧美国家 中60岁以上老年人有5～6％患有阿兹海默病。该病已被列为导致死亡的第四 大疾病，仅次于心脏病、癌症和中风。我国现有60岁以上人口约一亿，按照 60岁以上人口中老年性痴呆患病率为5％估算，全国可能有老年性痴呆患者约 500万。该病已给家庭和社会带来巨大的负担。

近几年的实验研究越来越多地证明，由A-beta单体凝聚形成丝状物的中间 产物-A-beta寡聚体是引起AD的主要致病因子，而不是先前认定的丝状聚集 体(Haass，C.等，2007，Nature reviews 8，101-112；Lesne，S，2006，Nature 440， 352-357；Shankar，G.M，2008，Nature medicine 14，837-842)。然而，目前国 际上现有的检测及治疗AD用抗体，大多是针对A-beta一级序列，即A-beta单 体的抗体，这类抗体能够和A-beta单体、寡聚体及丝状体同时结合，在实验研 究、病理检测及临床诊断中不能够特异地检测出真正起致病作用的寡聚体水平 的高低。同时，这类抗体在对AD的治疗中易引起大脑出血和脑膜脑炎等严重 的副作用。

Glabe实验室在2003年的Science杂志上报道了可以与寡聚体特异结合的 抗体A11(Kayed等，2003，Science 300，486-489)。但这种抗体是一种多克 隆抗体，在每一生产批次中含有的针对每一种抗原决定簇的各抗体成分的量无 法控制，影响检测结果的可比性。并且该抗体不仅与A-beta寡聚体结合，它还 与alpha-synuclein、Prion蛋白、胰岛素、溶菌酶等多种寡聚体结合，无一级序 列的特异性。

单链抗体(single chain FV，ScFv)是一个重要的基因工程抗体，是在DNA 水平上利用基因工程方法使抗体重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因 通过一段约5～25个氨基酸(linker)的连接肽连接形成的重组蛋白。单链抗体的 C末端可以引入半胱氨酸尾、酪蛋白激酶底物尾、E尾等结构，有助于标记和 偶联其它分子，也可以引入钙调蛋白尾、c-myc尾、葡萄球菌A蛋白尾、脂类 标签、组氨酸尾等，使表达产物易于检测和纯化。

单链抗体具有自身的一系列特点：

(1)只含有抗体的V区，能保持较完整的抗原结合位点；

(2)缺乏Fc段，不与非靶细胞结合，有利于作为药物导向载体用于临床；

(3)免疫原性低，用于人体不易产生抗异种蛋白反应；

(4)分子量小，容易穿透血管壁、组织及实体瘤；

(5)体内血循环半衰期短，易从血循环中排除；

(6)在其基因的3’端连接适当的目的分子，如：酶、毒素、药物等可构 建双功能抗体；

(7)只与抗原结合，不激活补体介导细胞免疫；

(8)易于基因操作和基因工程大量生产。

近年，单链抗体已逐渐成为基因工程抗体研究领域中的热点之一，在疾病 的临床诊断和治疗方面显示出了巨大的潜力。

目前，国际上仅见有一个关于特异结合A-beta寡聚体的单链抗体scFv的 报道(Zameer A等，2008，J Mol Biol.384：917-928)，该scFv与A-beta寡聚体 的亲和力较低。另有一类抗体NU1、NU2和NU4虽与A-beta单体结合不明显， 但是它们可以同时与A-beta寡聚体和丝状体结合，从而影响对样品中A-beta寡 聚体的检测(参见Lambert等，2007，Journal ofneurochemistry 100，23-35)。 到目前为止，国内尚未见特异结合A-beta寡聚体的单克隆抗体或单链抗体的报 道。