[发明专利]人Kappa阿片受体1的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及人Kappa阿片受体1的制备方法。

背景技术

人Kappa阿片受体1(Kappa Opioid Receptor，KOR1)，是Kappa阿片受体的一种亚型。Kappa阿片受体主要分布在中枢神经系统中，在外周神经系统、小肠和心脏等器官中也有分布。阿片受体能够被一些阿片肽类的内源性神经调质所激活，进而激活一系列下游信号通路，对疼痛有重要的调控作用。其中Kappa阿片受体的生理功能主要是参与镇痛，且与神经内分泌及免疫调节有关，另外也参与心脏功能的调节过程。虽然对阿片受体的研究已有20多年的历史和经验积累，它们的许多药理特性也已逐渐清晰，但由于阿片受体是一种膜蛋白，其表达和纯化极为困难，故对其蛋白质结构和功能所知甚少。目前的研究主要集中在阿片受体的分子克隆领域(阿片受体克隆研究新进展3，孙越，臧梦维，刘景生，中国药理学通报(ChinesePharmacological Bulletin 1999Dec；15(6)：497～500))和阿片受体的选择性激动剂和抑制剂的药物研发领域。因此，本领域迫切需要一种体外高效表达和纯化人KOR1蛋白的方法，以便能够大量生产供科学研究和药物设计所用的KOR1蛋白，以便用于KOR1蛋白的结构生物学研究，或进行药物成瘾实验，促进人们对该受体结构的了解，促进人们对药物成瘾机制的理解，为研制无副作用的镇痛药物提供新的线索，为治疗药物成瘾提供新的思路，对进一步探索KOR1蛋白重要的生物学功能将具有重要的理论和现实意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备人Kappa阿片受体1的方法。

本发明所提供的制备人Kappa阿片受体1蛋白的方法，包括如下步骤：将人Kappa阿片受体1蛋白的编码基因插入pET系列载体的多克隆位点，得到含有所述编码基因的重组表达载体，再将所述重组表达载体导入大肠杆菌BL21中，得到含有所述编码基因的重组菌，培养所述重组菌，得到人Kappa阿片受体1蛋白。

其中，所述培养包括如下步骤：将所述重组菌先在37℃条件下培养至菌液的OD₆₀₀值为0.65，再在12℃条件下培养至菌液的OD₆₀₀值为0.95，然后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导培养。

所述培养还可在振荡条件下进行，所述振荡的转速为225转/分钟，旋转半径为26mm；所述诱导培养的时间为48-60小时。

所述重组表达载体具体可以是通过将所述编码基因插入载体pET21b的多克隆位点得到的；所述编码基因的核苷酸序列具体可如序列表中序列1所示。

所述培养用到的培养基的组成为：Na₂HPO₄ 6.0g/L；KH₂PO₄ 3.0g/L；NaC l 0.5g/L；蔗糖4.0g/L；NH₄Cl 1.0g/L；CaCl₂ 0.0111g/L；MgSO₄ 0.12g/L；氨苄青霉素50mg/L，其余为水。

本发明的制备蛋白的方法还包括如下步骤：取上述诱导培养后得到的培养液，将所述培养液中的细胞破碎，弃沉淀取上清液，再进行亲和层析过滤，收集洗脱峰，得到人Kappa阿片受体1蛋白；所述亲和层析过滤的方法包括如下步骤：依次用洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2和洗脱缓冲液进行洗脱，收集所述洗脱缓冲液洗脱下来的洗脱峰；

所述洗涤缓冲液1包括：0.2％ AZ316，20mM Tris，200mM NaCl，1.4mM β巯基乙醇，其余为水；所述洗涤缓冲液1的pH值为8.0；

所述洗涤缓冲液2包括：0.2％ AZ316，30mM咪唑，20mM Tris，200mM NaCl，1.4mM β-巯基乙醇，其余为水；所述洗涤缓冲液2的pH值为8.0；

所述洗脱缓冲液包括：0.2％ AZ316，200mM咪唑，20mM Tris，200mM NaCl，1.4mM β-巯基乙醇，其余为水；所述洗脱缓冲液的pH为8.0；

所述百分含量均为质量百分含量。

在所述细胞破碎前，向所述培养液中加入细胞破碎液和β-巯基乙醇；所述细胞破碎液由70mM Tris和300mM NaCl组成，余量为水；所述细胞破碎液的pH值为8.0。

所述细胞破碎的方法具体可为超声波破碎；所述超声波破碎的方法为：超声强度为30W，超声环境为0℃，总超声时间为8分钟，超声工作方式为每超声作用5秒钟间隔7秒钟。