[发明专利]一种提高杂交瘤筛选效率的方法

说明书

发明所属领域：

本发明涉及单克隆抗体制备中分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选方法，该方法的建立旨在提高杂交瘤制备过程中的筛选效率，降低人工劳动强度，缩短筛选时间。是发展单克隆抗体通量化制备的重要基础之一。

发明背景：

单克隆抗体的概念

抗体主要由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。将激活的单一B细胞进行培养，得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，称为单克隆。单克隆细胞合成针对一种抗原决定簇的抗体，就是单克隆抗体(简称单抗)。

单克隆抗体技术的基本原理

1975年德国学者Kohler和英国学者Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞在体外进行两种细胞融合，形成杂交瘤(hybridoma)细胞，这种细胞继承两种亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞无限繁殖的特性，又具有合成和分泌抗体的能力。用这种来源于单个融合细胞增殖的细胞群，可制备针对一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。后来两人凭借此项成就获得诺贝尔生理学奖。时至今日单克隆抗体技术已经走过了30多个年头，在这30年中，单克隆抗体技术被不断发展并日臻完善，但有一个问题一直困扰着单抗制备的研究人员和制约着单抗的通量化和规模化生产，这一问题就是如何减少单抗制备过程中的人力成本，缩短单抗制备所需要的时间，从而降低单个单抗制作的成本。

杂交瘤细胞技术已经广泛应用于生命科学的各个领域，杂交瘤细胞所分泌的抗体-单克隆抗体是目前认为的最为成熟与可靠的分子识别工具，被广泛应用于生物学研究的各个领域，然而由于杂交瘤细胞株的制备周期长，所需的劳动强度高，已经成为制约杂交瘤细胞制备的重要瓶颈之一。本发明通过使用抗原偶联的固相介质(磁性材料)对细胞融合后的混合物进行筛选，分离出分泌抗原特异性抗体的杂交瘤细胞，然后通过半固体培养基的方法对杂交瘤细胞进行克隆化培养以进一步建立分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。该方法可以大幅度提高特异性抗体筛选的阳性率，降低筛选工作的劳动强度，缩短杂交瘤细胞制备所需要的时间，在大规模单克隆抗体制备中具有重要的应用前景。

单抗制备过程中最重要也是最为需要人力资源的一步是分泌特异性抗体的筛选工作，好的筛选方案是单克隆抗体制备成功与否的关键，目前通用的筛选方法是通过固相酶联实验(ELISA)法进行筛选，从成千上万个融合后的杂交瘤细胞中筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，随着制备过程的进行，有些不稳定的杂交瘤细胞失去了分泌特异性抗体的功能，在制备的末期甚至会失去全部的分泌特异性抗体的杂交瘤，导致单抗制备的失败。几十年来，在筛选的方法上也存在众多的改进，如通过流式细胞仪对杂交瘤细胞所分泌的抗体进行筛选，可以筛选出亲和力较高的抗细胞膜抗原的单抗，近年来蛋白芯片技术的不断成熟也为单抗的筛选提供了一些新的方法，Sawyer利用蛋白芯片结合多蛋白的复合免疫，进行单抗的制备，取得了较好的结果。但所有这些改进，对于筛选中工作量的降低都不明显。

单抗制备过程中的另外一个需要工作量较大的部分是克隆化培养，目前常用的方法是有限稀释法，由于杂交瘤细胞的基因组的不稳定性，使得其在后续的培养中，会发生染色体丢失现象，即使杂交瘤细胞在建株后，仍可能会丢失编码抗体的染色体，使杂交瘤细胞失去分泌特异性抗体的能力，因此，在单抗制备初期，人们总是尽可能多的将所有阳性细胞进行克隆化培养，以期最大限度的保留分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，从而造成了巨大的工作量。基于这种情况，人们对细胞克隆化培养技术进行了改进，引进了半固体培养基对细胞进行克隆，具体做法是利用商业化的甲基纤维素对欲克隆的细胞进行培养，细胞在这种培养基中可以形成独立的细胞克隆，在克隆长到可以用肉眼识别的大小时将其挑出，进行培养，这样得到了阳性克隆易于后面的筛选工作，从而降低了由于不分泌抗体的细胞的生长快于分泌抗体生长的细胞而造成的分泌特异性性抗体的丢失现象。同时半固体培养基的使用，也有利于单抗制备的机械化处理。节省人力成本。

发明内容：

本发明的目的是要提供一种可以显著提高分泌特异性抗体的杂交瘤细胞的筛选效率的方法，该目的的实现是通过偶联(包被)有靶抗原的固相材料(如磁性小球-磁珠)，通过免疫亲和作用，将细胞融合后杂交瘤混合物中分泌抗靶抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞筛选出来，通过进一步的培养和克隆化培养，从而达到提高分泌特异性抗体的杂交瘤细胞的筛选效率的目的。本发明提供了实现上述目标的具体方法，包括：