[发明专利]一种快速检测卡介苗活菌含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及活菌疫苗质量监测技术领域，是一种定量的快速检测卡介苗活菌含量的方法。

背景技术

肺结核病是一种慢性传染疾病，其传染途径主要是通过呼吸道传染，目前已成为传染病的首要杀手，近年来发病率有上升的趋势，给我国的国民经济生活、人民生命健康造成了极大的危害。因此，对结核病的预防和早期诊治具有重要的现实意义。

当前，对结核病的预防和控制所采取的主要措施是接种预防性疫苗——卡介苗。卡介苗是一种减毒的活性牛型结核杆菌疫苗，它注入人体后，能使人体内产生对结核杆菌的免疫力，防止感染和发生结核病，尤其在减少和控制儿童重症结核和结核性脑膜炎的发病及死亡方面的作用更为显著。现在世界上多数国家都已将卡介苗列为计划免疫必须接种的疫苗之一。在卡介苗药物的生产和保存过程中，需要对卡介苗质量进行监测，即活菌数是否达到合格标准(活菌数＞1×10⁶个/mg)，即将1mg卡介苗样品配制为1mL溶液，则合格标准为活菌数＞1×10⁶个/mL。常规的检测方法是取一定量的试样在试管中进行活菌斜面培养计数，但培养时间通常需要1个月，导致疫苗在库内存放期延长，缩短了疫苗的有效期，且这种方法操作复杂，检测效率较低，国家检定部门及防疫系统在监测疫苗质量时亦不能及时获得结果，影响了质量管理。因此，急需要建立一种快速、简便、准确的卡介苗活性检测方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，公开一种快速检测卡介苗活菌含量的方法，无需培养，检测快速，解决了传统培养法耗时长，效率低等问题，为活菌疫苗质量监控提供了关键技术。

为达到上述目的，本发明的技术解决方案是：

一种快速检测卡介苗活菌含量的方法，包括四个步骤：

A)制作标准ATP曲线：

检测ATP标准溶液的发光强度，作出ATP标准溶液浓度与其发光强度的标准曲线，获得线性回归方程；

B)样品前处理，提取活菌ATP：

将冻干卡介苗用缓冲液稀释为合适浓度的样品溶液，对样品溶液进行裂解处理，提取卡介苗活菌中的ATP；

C)卡介苗样品生物发光测定：

将处理过的卡介苗样品溶液进行发光检测，获得样品溶液的发光强度；

D)卡介苗ATP浓度及活菌数计算：

由于各生长时期的活菌中ATP含量大致相同，研究证明平均每个卡介苗活菌中的ATP含量为2.03～2.63fg。根据标准曲线回归方程推算出卡介苗的ATP含量，即可推算出活菌数量。

所述的快速检测卡介苗活菌含量的方法，其所述B)步中对卡介苗样品中ATP的提取，是通过加热方法来裂解卡介苗活菌，实现对活菌内ATP的提取。

所述的快速检测卡介苗活菌含量的方法，其所述B)步中对卡介苗样品中ATP的提取，是将预热到80℃～100℃的ATP提取剂与样品溶液混合后，再在80℃～100℃内继续加热2～20min。

所述的快速检测卡介苗活菌含量的方法，其所述ATP提取剂，含有15～150mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)(pH 7.8)，0.1～8mM乙二胺四乙酸(EDTA)；0.1～30mg/mL十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)，曲拉通(Triton X-100)，二甲基亚砜(DMSO)中至少一种。

本发明提供的快速检测卡介苗活菌含量的方法，无需对活菌进行培养，具有快速，操作简便，重复性好等优点。

本发明方法不局限于卡介苗活性的检测，也适用于其他活菌疫苗质量的监控和真菌等其他微生物标准品的计数。

附图说明

图1是本发明方法的卡介苗活菌数的检测流程图。

具体实施方式

本发明的一种快速检测卡介苗活菌含量的方法，所使用的生物发光试剂的制备方法，请参照申请号为：200610112410.0的已申请专利。

本发明的一种快速检测卡介苗活菌含量的方法，是通过对卡介苗样品进行前处理，检测卡介苗活菌中ATP含量，从而推算其活菌数目。

本发明的一种快速检测卡介苗活菌含量的方法，所用的ATP提取剂，是由15～150mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)(pH 7.8)，0.1～8mM乙二胺四乙酸(EDTA)；0.1～30mg/mL十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)，曲拉通(Triton X-100)，二甲基亚砜(DMSO)中至少一种组成。