[发明专利]β-聚苹果酸及其盐的制备方法

说明书

技术领域

本发明的技术方案属于发酵工程技术领域，具体涉及采用膜技术回流菌 体、截留浓缩β-聚苹果酸和控制β-聚苹果酸聚合度，及采用树脂制备β-聚 苹果酸盐、β-聚苹果酸和普鲁兰多糖的方法。

背景技术

1969年，研究圆弧青霉菌(Pencillium cyclopium)的微生物学家Shimada 和Matsushima等推测该菌中可能存在含苹果酸结构单元的聚合物，该聚合物 能够抑制圆弧青霉菌的酸性蛋白酶活性，最终证实该聚合物为聚苹果酸。1979 年，Vert等首次合成了水溶性脂肪族聚酯——聚苹果酸，它以聚苹果酸为唯 一单体。1989年，Fisher等从黏菌(Physarum Polycephalum)细胞中分离出 聚苹果酸，并发现它是DNA聚合酶α的抑制剂。迄今为止，以Vert、Cammas、 Kajiyama等为代表的国外学者已对聚苹果酸性能和应用做了较深入的研究， 目前国内外有关利用微生物发酵生产聚苹果酸的专利非常少，已有的发酵生 产或人工合成聚苹果酸(苹果酸聚合物)的专利有：1995年公开的日本专利 “生产苹果酸聚合微生物的培养方法(JP7308188A2)”、1991年公开的日本 专利“酶法生产L-苹果酸聚合物(JP4341189A2)”和1992年公开的日本专 利“微生物合成L-苹果酸聚合物(JP4211385A2)”，这些专利着重描述了产 聚苹果酸菌株的培养方法，及醇析获得聚苹果酸的方法；美国专利 US4320753，主要是合成聚苹果酸和相应β-内酯的衍生物；中国专利 CN101100687，公开了采用不同乙醇浓度醇析，同时获得普鲁兰和聚苹果酸 的方法。而关于聚苹果酸应用的专利较多，如：US05811032、US05324519、 US5702716等多达90余项。

聚苹果酸是一种特殊的脂肪族聚酯，以苹果酸为唯一单体、相互通过酯 键联接而成。它是天然多聚物中新近开发的一种生物多聚物。与许多其它天 然多聚物不同，聚苹果酸分子中有许多自由羧基和非对称碳原子，这些自由 羧基赋予了它许多特别的性质，它除了具有良好的水溶性、可生物降解性、 生物相容性和生物可吸收性之外，还具有两个显著的优点：(1)易代谢性。由 于L-苹果酸是生物体内克雷伯氏三羧酸循环的中间体，β-聚苹果酸容易在 生物体内通过正常的三羧酸循环代谢途径除去；(2)易修饰性。聚苹果酸具有 悬挂羧基，容易与其它官能团反应而制得聚苹果酸衍生物，或引入功能基团 或小分子药物，从而制得许多具有特殊功能的产物。因此，聚苹果酸及其衍 生物可作为手术缝合线、组织工程支架材料、药物载体或原生药物、药物控 制释放体系、食品包装材料、化妆品等，在生物医药、食品、化妆品等领域 获得重要的应用。

聚苹果酸可以通过化学的或生物的方法合成，目前两种方法都在研究中。 通过化学合成可以得到3种聚苹果酸，即α、β、γ3种类型；而从微生物 细胞中分离的聚苹果酸仅有β型一种。同化学合成相比，生物合成产品的分 子量较高，可达200～760kDa，而化学合成的聚苹果酸分子量最多为174kDa。 另外，生物合成所需的原料简单易得，反应条件温和，具有较大的开发应用 前景。

出芽短梗霉生产聚苹果酸过程中的主要副产物是普鲁兰多糖，其易溶于 水，不溶于乙醇。它是一种具有极好的成膜、成纤、阻气、粘结、无毒性生 物高分子，已广泛应用于生物医药和食品等领域。

到目前为止，发酵法生产β-聚苹果酸没有大规模的应用，其主要原因是： 发酵周期过长，产率低，生产成本过高，生产的β-聚苹果酸为多种聚合度的 复合物。

发明内容

本发明所解决的技术问题是：发酵过程中利用膜技术回流菌体和截留、 浓缩高分子量β-聚苹果酸，使低分子量β-聚苹果酸、苹果酸及其它成份回 流于发酵过程，降低末端产物β-聚苹果酸对β-聚苹果酸合成过程的抑制作 用，提高发酵过程的菌体密度，控制发酵过程β-聚苹果酸的聚合度，缩短发 酵周期。采用弱碱性阴离子交换树脂，吸附β-聚苹果酸且使普鲁兰多糖溶液 透过，采用碱性溶液洗脱树脂上吸附的β-聚苹果酸，得到β-聚苹果酸盐。 采用强酸性阳离子交换树脂吸附β-聚苹果酸盐溶液中的盐离子，经膜浓缩得 游离态的β-聚苹果酸。

本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：

1.β-聚苹果酸及其盐的制备方法包括如下步骤：

(1)接种发酵