[发明专利]检测化合物抗过敏作用的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测化合物抗过敏作用强弱的方法，特别涉及一种 通过观察鸡胚尿囊卵黄膜血管的变化程度来检测化合物抗过敏作用强弱的方法。

背景技术

近年来过敏物质所致皮肤疾病正在逐年增多，成为皮肤科常见疾病之一。对于化合物抗 过敏性的评价也越来越引起人们的注意，传统对化合物的抗过敏性的评价主要以动物试验为 主，但在全球化的动物保护运动的影响下，发达国家普遍开展了以替代(replacement)、减 少(reduction)和优化(refinement)为核心的“3R”运动，体外替代实验将逐步取代动物 实验。欧盟2003年3月正式通过化妆品指令2003/15/EC，其主要议题就是对化妆品成品及 其成分的非动物测试的规定和限制。很多国家都在对动物替代评价体系进行研究。

目前对化妆品眼刺激性的动物替代方法研究中，鸡胚绒毛膜尿囊膜动物替代试验法 (hen’s egg test chorioallantoic membrane，HET-鸡胚绒毛尿囊膜)是研究中的热点。鸡 胚尿囊膜绒毛膜是鸡胚的呼吸膜，血管丰富，紧贴于蛋壳膜下，鸡胚尿囊膜绒毛膜试验通过观 察尿囊膜暴露于化学物质后血管的变化——充血、出血和凝血并计算刺激分值，根据结果对 受试物评分操作简单，费用较低，重现性好，与体内试验结果的相关性高，值得推广。但该方 法中，传统的是将鸡壳开窗，直接将测试物质加到暴露的尿囊膜绒毛膜上，视野窄，鸡胚血 管网个体差异大，不好统一标准，并且仅仅能够评价急性刺激性(5min内的)，而且该方法 也没有用于对化合物抗过敏性的评价方面应用的记录。

发明内容

本发明的发明目的是，提供一种体外进行化合物抗过敏作用检测的方法，而且可以降低 试验的成本，提高试验的准确性，一致性。

本发明提供一种检测化合物抗过敏作用的方法，依次包括以下步骤：

1、将受精鸡卵用75％酒精消毒后置于有加湿水盘的孵箱中孵化75到100小时；

2、打开蛋壳，将鸡胚移入75到90mm直径的无菌玻璃平皿中，平皿中预先加入预热37 ℃的开壳缓冲液1到4ml，开壳缓冲液的成分为CaCL₂.2H₂O：0.265g/l；无水MgSO₄：0.09767 g/l；KCl：0.4g/l；NaHCO₃：2.2g/l；NaCl：6.8g/l；无水Na₂HPO₄：0.122g/l；青霉素： 0.066g/l；链霉素：0.154g/l；

3、选择卵黄膜未破、鸡胚尿囊卵黄膜血网管位于卵黄中央上方的鸡胚，盖好平皿盖，放 入37.5℃恒温孵育箱中继续孵育到第8到15天；

4、选择鸡胚尿囊卵黄膜血管发育好的的鸡胚，随机进行分组，分别加入不同浓度待测化 合物和空白对照物，加入待测化合物和空白对照物的方式为鸡胚尿囊卵黄膜血管网表面滴加 或血管内注射，之后将鸡胚放入37.5℃恒温孵育箱中继续孵育，在继续孵育到1小时或12 小时或24小时或48小时的时候，在鸡胚尿囊卵黄膜血管网表面滴加等量的浓度为1％十二 烷基硫酸钠或0.1mmol/L NaOH等已知对鸡胚尿囊卵黄膜血管有刺激性的物质，上述操作均是 在无菌的环境下完成，依照刺激因子法对血管的变化进行评分，并计算不同浓度抗过敏化合物 的抑制率。

本发明提供的检测化合物抗过敏作用的方法，其中所述打开蛋壳的方法为，用牙科钻在 蛋壳中央垂直长轴磨切出一道1.5到5cm长切口，以切口为界向两侧掰开蛋壳。

本发明提供的检测化合物抗过敏作用的方法，其中所述待测化合物为水溶性成分，将其 溶于生理盐水中，各剂量组滴加0.1到1ml或血管注射0.1到0.5ml。

本发明提供的检测化合物抗过敏作用的方法，其中所述待测化合物为水溶性差的成分， 先用二甲基亚砜将该化合物溶解，并用生理盐水将二甲基亚砜浓度稀释至小于0.1％，各剂量 组加入的化合物的量为，滴加时0.1ml到1ml或血管注射时0.1ml到0.5ml。