[发明专利]多重PCR产物的悬浮芯片检测方法

说明书

技术领域

本发明提供一种对多重PCR产物的悬浮芯片的非诊断性检测方法， 本发明还涉及对悬浮芯片检测方法中条件的改进。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)简称PCR，是一种 模拟天然DNA复制的体外扩增法。PCR技术的问世给分子诊断带来一场革 命。PCR技术已经成为分子诊断的基础。目前PCR产物的检测方法为琼脂 糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶仅约可区分相差100bp的DNA片段。片段 长度相差不大或者相等的PCR产物，琼脂糖凝胶电泳将无能无力。另外， 琼脂糖凝胶电泳通过紫外光激发荧光染料产生荧光来判断是否存在PCR 产物，检测灵敏度相对较低。且琼脂糖凝胶电泳通过片段的大小对产物 进行判断，特异性差，对非特异扩增的大小相似的片段不能区分。而且 常用的染料如溴化乙锭等具有致癌性，常操作对身体健康不利。

悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片(liquid array，liquid  chip)，是一种非常灵活的多功能技术平台，可以进行蛋白、核酸等生物 大分子检测、受体和配体识别分析等研究。悬浮芯片主要通过可偶联探 针的荧光编码微球与两束激光检测，对被测物的定性和定量分析，一个 反应孔内可以完成100种不同的生物学反应。可实现对核酸的多重检测。

发明内容

本发明提供一种多重PCR产物的悬浮芯片的非诊断性检测方法，该 方法利用悬浮芯片技术结合核酸探针技术对标记上生物素的PCR产物进 行特异性的识别，检测灵敏度高，特异性好，尤其适用于多重PCR产物 相似长度片段的区分，且理论上可对100种不同的PCR产物进行区分， 实现100种不同因子的检测。

本发明提供的技术方案是一种多重PCR产物的悬浮芯片的非诊断性 检测方法，该方法包括：首先PCR扩增引物标记生物素，再根据PCR扩 增区域内的核苷酸序列设计特异性捕获探针，并提交GENEBANK检测探针 的特异性；所述捕获探针分别与相应的编码微球偶联；该捕获探针在一 定的条件下特异的捕获生物素化的PCR产物；然后加入链霉亲和素-藻 红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，利用悬浮芯片LUMINAX 系统进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光和微球表面经特异 性反应结合上的藻红蛋白，对待检测物进行定性和定量分析。

本发明还提供一种多重PCR产物的悬浮芯片的非诊断性检测方法， 包括以下步骤：1、PCR引物标记生物素，2、根据待检测的PCR产物，选 择设计位于扩增区域内的特异的捕获探针；3、相应的探针偶联微球；4. 捕获探针捕获待检测的PCR产物并检测。

在本发明的方法中，首先据待检测的PCR产物，设计位于扩增区域 内的特异的捕获探针，每条探针长20-30bp，在合成时连接C12或15-20 个poly(T)作为加臂，氨基化修饰，以便与微球偶联。

在将相应的探针与微球偶联时，例如，包括以下步骤：

a)分别选取不同编号的编码微球，用漩涡振荡器振荡微球悬液，使 微球混合均匀，转移至离心管，14000a离心，小心吸出上清；

b)加入2-(n-吗啉代)乙磺酸溶液，振荡超声，使微球重悬；

c)用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释；将稀释的探针加于微球悬 浮液中，振荡混匀；

d)加入新鲜配制的EDC溶液至微球与探针的混和液中，振荡混匀；

避光，漩涡振荡器上振荡，室温孵育30分钟；再次加入新鲜配制 的EDC；再次在漩涡振荡器上振荡，室温避光孵育；

e)用0.02％PBST 1ml洗涤，14000g下离心；移弃上清，微球重悬于 0.1％SDS中，洗涤，离心；

f)移弃上清，微球重悬于100ul pH8.0TE中，振荡悬起混匀，即得 到偶联好的检测微球。

本发明优选的方法包括以下步骤：

g)分别选取不同编号的编码微球，用漩涡振荡器振荡微球悬液，使 微球混合均匀。

h)分别取上述微球大约1.25x10⁶个，分别转移至离心管，14000g离 心3-5min，小心吸出上清。

i)加入50ul 0.1mol/L的2-(n-吗啉代)乙磺酸溶液，振荡20-30S， 超声20-30s，使微球重悬。

j)用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释到0.1mmol/L。