[发明专利]一种定量检测葡萄球菌肠毒素B的蛋白质悬浮芯片及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种定量检测葡萄球菌肠毒素B的蛋白质悬浮芯片及其制备方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)是引起食物中毒的主要致病因素。食物中毒发病较急，通常在进食含毒素食品1-6小时内发作，平均2-3小时。

SEB常规实验室诊断方法有：1)免疫扩散：Oudin单向扩散技术可用于葡萄球菌肠毒素的准确定量测定，易重复，不受温度、抗血清稀释度及作用时间等影响。检测各型葡萄球菌肠毒素的敏感度在10-20μg/mL左右。2)放射免疫法(RIA)：检测食品中的肠毒素A及B，较免疫扩散法敏感100倍。3)反向被动血凝试验(RPHA)：可将毒素分型，且有较高的特异性和敏感性。用改良的RPHA法测定葡萄球菌肠毒素时，食物中纯化葡萄球菌肠毒素的最低检出浓度为1-5ng/mL。本法优点为简便、快速，且对食品中低浓度毒素不需浓缩即可检出。4)被动血凝抑制试验(RPIA)：用戊二醛为结合剂，以冻干致敏红细胞作被动血凝抑制试验测定葡萄球菌肠毒素B。可测出0.01ng葡萄球菌肠毒素，但如食品浸出液不纯，常可干扰检查结果。SEB的检测研究在平时和战时都有重要意义。本发明选择SEB作为葡萄球菌肠毒素的代表建立检测模型。

悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片(liquid array，liquidchip)，是20世纪70年代美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。最早的报道是1977年Horan将该技术用于免疫学检测，至今，该技术已广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分析等领域。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.5μm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应。反应后，利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通道。检测通道中设有两道激光，一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目；一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时，两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的微球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。

本研究选择金黄色葡萄球菌肠毒素B作为病原体和生物威胁因子，制备相应的蛋白质悬浮芯片并且用于对实际生活领域中如奶粉、面粉、淀粉、果珍等粉末样品中的快速检测，分析悬浮芯片方法在白色粉末模拟样品检测中的应用情况，包括敏感性、特异性、稳定性以及针对不同样品、具有杂菌干扰下检测方法的适用性。

发明内容

本发明涉及一种定量检测葡萄球菌肠毒素，特别是金黄色葡萄球菌肠毒素B的蛋白悬浮芯片及其制备方法，还涉及本发明的蛋白质悬浮芯片在定量、快速、直接检测葡萄球菌肠毒素、尤其是金黄色葡萄球菌肠毒素B中的应用和检测方法。

本发明人通过大量和深入的研究，开创性开发出本发明的葡萄球菌肠毒素检测蛋白质悬浮芯片及其检测方法具有以下优点：制备的蛋白质悬浮芯片能够更快速、定量检测所述病原体，特异性强；蛋白质悬浮芯片检测方法比ELISA方法检测敏感度高，并且动态范围更宽；为所述病原体的定量检测建立技术模型，例如蓖麻毒素，而且还可以进一步奖所述蛋白悬浮芯片应用于其他植物毒素等。

本发明提供一种定量检测葡萄球菌肠毒素的蛋白质悬浮芯片，该悬浮芯片由：编码微球包被抗体、生物素化抗体、链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)及缓冲溶液构成，该微球用抗葡萄球菌肠毒素B(SEB)的特异性抗体包被，生物素标记的抗体为SEB特异性抗体。

本发明还提供一种制备所述蛋白质悬浮芯片的方法，该方法包括下列步骤：(1)用捕获抗体包被编码微球，(2)生物素标记检测抗体，(3)样品检测方法。