[发明专利]禽流感病毒的快速检测荧光标记试纸条制造方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物疫病检测方法技术领域，具体的讲是禽流感病毒的快速检测荧光标记试纸条制造方法。

背景技术

禽流感(Avian Influenza，AI)，俗称鸡瘟，是由A型流感病毒引起的一种禽类感染性疾病综合症。1878年，在意大利鸡群中首次发现该病毒。现在该病几乎遍布世界各地，对世界养禽业的发展，甚至对人类的健康都造成了严重威胁。禽流感特别是H5和H7亚型高致病性禽流感(HPAI)已经被国际兽医局(OIE)定为A类烈性传染病，曾在历史上造成过巨大的灾难。普通的的血凝抑制试验(HI)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，琼脂糖扩散实验(AGID)，免疫荧光技术(IFT)，基因扩增方法(PCR)等，都需要一定的实验器械和较为专业的技术操作人员，且耗费时间长。目前胶体金检测法方法广泛应用于样品初筛，但缺点是检测灵敏度较低，难以进行定量检测，而且检测结果不易记录和保存。

发明内容

为了克服上述缺点，本发明的目的是发明一种禽流感病毒快速检测荧光标记试纸条制造方法。它的技术方案为：(1)采用荧光纳米颗粒作为标记物；(2)荧光纳米颗粒与抗体的标记；(3)将荧光纳米颗粒标记好的禽流感单克隆抗体A均匀滴加在玻璃纤维素膜上，37℃温箱中烘烤1h。(4)硝酸纤维素膜上用三维点膜仪分别喷上羊抗鼠IgG抗体作为质控线，禽流感单克隆抗体B为检测线。(5)按照(4)加工好的硝酸纤维素膜、按照(3)加工好的玻璃纤维素膜和吸水纸的先后顺序，将各部分粘贴在支撑板上制造成禽流感病毒的快速检测荧光标记试纸条。(6)在试纸条的样品垫上加待测样品，20min后在紫外光下进行肉眼观察或者通过凝胶成像系统测量读数。阳性结果呈现两条红色的带，而阴性结果只呈现一条红色的带。该方法检测结果还可以通过凝胶成像系统进行读数以及数据图像的保存。

该发明的优点是：生物安全性高。本发明所涉及到的禽流感病毒的各项单克隆抗体，没有生物危险性。制备过程中不涉及禽流感活病毒，因此没有禽流感活病毒逃逸、扩散的潜在危险。与其他已公开的禽流感病毒检测其他方法相比，本试纸条具有简便、快速、稳定的优点；操作简便，只需一步反应，不需由专业人员操作；检测成本低，对人体无危害，检测灵敏度高，检测方式灵活等。

具体实施方式

一、材料

50nm荧光纳米颗粒、羊抗鼠IgG抗体、禽流感单克隆抗体

硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、吸水纸、支撑板

二、工艺流程

(1)用反向微乳法制得尺寸为50nm适合于蛋白标记的荧光纳米颗粒。

(2)荧光纳米颗粒与抗体的标记：取亲和纯化的禽流感单克隆抗体A200μL(0.5mg/mL)，用0.025M碳酸盐缓冲溶液(pH 9.5)4℃透析6h；然后加入100μL悬浮于碳酸盐缓冲溶液中的荧光纳米颗粒(8mg/mL)，4℃过夜；加入NaBH₃CN，终浓度为5mM，反应2h；再加等体积的封闭液(10mM tris 7.8，含2％BSA、4％蔗糖)最后用10mM tris 7.8洗涤标记好的抗体3遍，然后用100μL 10mM Tris 7.8(含0.9％NaCl、0.2％BSA、0.1％NaN₃)悬浮，4℃保存。

(3)将荧光纳米颗粒标记好的禽流感抗体A稀释100倍均匀滴加在玻璃纤维素膜上，每试纸条加入4μL，37℃温箱中烘烤1h。

(4)硝酸纤维素膜上用三维点膜仪分别喷上浓度为0.5mg/mL的羊抗鼠IgG抗体作为质控线，浓度为0.4mg/mL的禽流感单克隆抗体B为检测线。

(5)按照(4)加工好的硝酸纤维素膜、按照(3)加工好的玻璃纤维素膜和吸水纸的先后顺序，将各部分粘贴在支撑板上制造成禽流感病毒的快速检测荧光标记试纸条500条。

以上实施方式仅用于帮助本领域技术人员更加全面的理解本发明，但并不对本发明做任何限制。凡依照本发明的内容所做出的任何本领域等同的替换均属于本发明保护的范围之内。