[发明专利]一种13C稳定性同位素标记纤维素的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及稳定性同位素标记化合物生产领域，尤其涉及采用微生物发酵制备¹³C稳定性 同位素标记纤维素高分子聚合物的方法。

背景技术

自然界的纤维素绝大部分是由植物产生的，少数微生物也能合成纤维素，微生物合成的 纤维素与天然纤维素结构非常相似，都是由葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接而成的高分子化合物。 能够合成纤维素的微生物种类很多，主要有：醋酸杆菌属(Acetobacter)、产碱菌属 (Alcaligenes)、八叠球菌属(Sarcina)、根瘤菌属(Rhizobium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、 固氮菌属(Azotobacter)和气杆菌属(Aerobacter)。其中比较典型的是醋酸杆菌属中的木醋杆 菌(Acetobacter xylinus)，它具有很高的纤维素生产能力。

通常采用化学方法合成稳定性同位素标记的化合物，利用生物法合成稳定性同位素标记 化合物的报道较少，中国专利公开了一种利用生物发酵法合成¹⁵N稳定性同位素标记精氨酸 (CN 1869244A)、¹⁵N标记亮氨酸(CN 101235402A)的方法等。但是，还未见有利用微生物 发酵合成并有效制备¹³C稳定性同位素标记纤维素的专利报道。利用微生物合成¹³C稳定性同 位素标记纤维素，¹³C容易标记且丰度高，工艺简单，制备方便。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用微生物发酵合成并制备¹³C稳定性同位素标记纤维素的方 法。

本发明所述的¹³C稳定性同位素标记纤维素的生产制备方法如下：

(1)选用菌株

选取适用发酵生产细菌纤维素的醋酸杆菌属，以木醋杆菌(Acetobacter xylinus)为代 表。

(2)发酵培养基

以¹³C₆葡萄糖为唯一碳源的M9基本培养基，其配方为：磷酸氢二钠5.0～7.0g/l，磷酸二 氢钾2.0～4.0g/l，氯化钠0.5～1.0g/l，氯化铵1.0～2.0g/l，MgSO₄·7H₂O 0.4～0.5g/l，CaCl₂·2H₂O 10～15mg/l，¹³C₆葡萄糖10～30g/l。

(3)静置培养

取1环活化好的斜面种子接入液体活化培养基，30℃振荡培养24～36h，摇床转速为 160rpm，作为预培养的种子。

静置培养前的预培养：将上述种子接种¹³C₆葡萄糖-M9液体培养基，接种量6～8％， 28℃～30℃振荡培养24～36h，摇床转速为160～180rpm，作为静置培养的种子。

静置培养：将¹³C₆葡萄糖-M9液体培养基活化的种子，接种¹³C₆葡萄糖-M9液体培养基， 接种量6～8％，28℃～30℃静置培养30d左右。静置培养采用浅层培养的方法，95mm直径 的灭菌扁烧杯盛有50～80ml ¹³C₆葡萄糖-M9液体培养基，可换气的培养用膜封口。

(4)分离提纯

将静置培养获得的¹³C稳定性同位素标记纤维素置于已预热至60℃～80℃的蒸馏水中， 60℃～80℃振荡洗涤20min～30min，摇床转速为150～250rpm；取出¹³C稳定性同位素标记 纤维素并置于已预热至60℃～80℃的1mol/l的NaOH溶液中，60℃～80℃振荡洗涤20min～ 30min，摇床转速为150～250rpm；取出¹³C稳定性同位素标记纤维素并置于已预热至60℃～80 ℃的1mol/l的HAC溶液中，60℃～80℃振荡洗涤20min～30min，摇床转速为150～250rpm， 重复三次；最后用双蒸水冲洗¹³C稳定性同位素标记纤维素，冷冻真空干燥获得产品。