[发明专利]马铃薯金线虫检测用引物及探针

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体地说涉及马铃薯金线虫检 测用引物、探针及其检测方法。

背景技术

马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(G. pallida)合称马铃薯孢囊线虫，是马铃薯上毁灭性的有害生物之一， 也是国际上公认的重要检疫性有害生物，据估计在欧洲每年造成的 经济损失达数亿欧元，目前已经随带土的马铃薯种薯传播到几乎所 有的马铃薯生产国家。由于我国采取了严格的植物检疫措施，禁止 从疫区国家输入种用马铃薯种薯，目前马铃薯孢囊线虫我国未尚有 发生。但是，在中国入世谈判过程中，分别与加拿大和荷兰签署了 有关进口种用马铃薯的植物检疫议定书，其后又与美国、英国签署 了类似的议定书，因此，该线虫随进口马铃薯种薯传入我国的风险 日益增大。

本研究选择马铃薯金线虫ITS序列设计一条荧光标记探针和一 对引物，建立了马铃薯金线虫的荧光PCR检测方法，可快速准确地 检测马铃薯金线虫。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了用于马铃薯金线虫实时荧 光PCR检测的引物、探针及其检测方法。

本发明通过分析已报道马铃薯金线虫ITS序列的基础上，分别 设计引物和荧光探针。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核 苷酸序列分别为正向引物SEQ ID No.1(FP)和反向引物SEQ ID No.2 (RP)，所述探针核苷酸序列为SEQ ID No.3(LP)。

本发明还进一步给出了应用上述引物和探针的荧光PCR检测方 法，其以样品总DNA为模板，反应结束后根据扩增曲线判定结果。

具体地说本发明以样品总DNA为模板，进行实时荧光PCR反 应，即在25μL反应体系中加入2.5μL 10×反应缓冲液(1mM Tris-HCl pH 9.0，5mM KCl，0.01％X-100)，2mM Mg²⁺，50μM dNTP， IU Taq DNA聚合酶，上下游引物FP和RP各400nM，200nM TaqMan探针，lng模板DNA，最终用灭菌水补足25μL。

其中TaqMan探针是探针SEQ ID No.3的5’端标记有FAM荧光 染料，3’端标记淬灭基团TAMRA。

其中，上述反应条件可以是：反应程序为第一步95℃3min， 第二步95℃15s，60℃25s，40个循环。

当然，可以根据本发明给出的引物对或者其扩增产物序列设计 其他类型的探针，以适用不同方法的荧光PCR检测。

进一步，还可以将本发明引物、探针以及相关试剂组装成试剂 盒，以方便使用。

更具体地，本发明的技术方案为：

本发明提供了一种马铃薯金线虫检测用引物，其核苷酸序列 为：

SEQ ID No.1(正向)：5’-ACTCCATGTTGTACGTGCCG-3’

SEQ ID No.2(反向)：5’-CACGGCCACGGACGTAG-3’

本发明还提供了一种与权利要求1所述引物配合使用的探针， 该探针的核苷酸序列为：

SEQ ID No.3：5’-TGCGGCATGTCTGCGCTTGTG-3’

该探针一端标记有报告荧光染料，另一端采用了淬灭基团。

更具体地，上述探针的5’端标记有FAM荧光染料，3’端标记淬 灭基团TAMRA。

本发明还提供了一种检测马铃薯金线虫的检测方法，该方法以 样品总DNA为模板，利用上述引物以及探针进行实时荧光PCR扩 增，反应结束后根据扩增曲线判定结果。

上述实时荧光PCR的反应过程程序为第一步95℃3min，第二 步95℃15s，60℃25s，40个循环后观察反应结果。

本发明还提供了一种含有上述引物FP和RP的试剂盒，该试剂 盒还可以包括上述的LP探针。

本发明的根据马铃薯金线虫ITS序列设计上述引物及探针具有 优异的特性，探针的特异性好，用于荧光PCR检测灵敏性高。其能 够快速简单地判断样品是否有马铃薯金线虫，为进出口安全提供了 保证。

附图说明