[发明专利]利用淡水发光细菌检测铜污染土壤急性毒性的方法

权利要求书

1.一种利用淡水发光细菌检测铜污染土壤急性毒性的方法，其特征在于，所述方法选用淡水发光细菌作为检测用细菌，包括以下步骤：

第一步，制备淡水发光细菌的菌悬液，对4℃保存的淡水发光细菌的纯化菌株进行活化和液体培养，用土壤背景溶液制成菌悬液；所述土壤背景溶液为含2.5mMCaCl₂·2H₂O，1.5mM KNO₃，0.6mM Na₂SO₄，3.3mM NH₄NO₃，1.0mM MgSO₄·7H₂O的溶液；

第二步，提取土壤孔隙水，采用双室离心法提取土壤孔隙水，将玻璃纤维置于注射器底部，在注射器中加入待测土壤，向土壤中加入去离子水，当水与土壤充分混匀后，将注射器放入离心管，离心后收集土壤溶液过滤，得到土壤孔隙水；

第三步，检测土壤样品的毒性，将土壤孔隙水加入样品管，在样品管中加入所述菌悬液并混匀，15分钟后，用发光仪检测发光值。

2.根据权利要求1所述的一种利用淡水发光细菌检测铜污染土壤急性毒性的方法，其特征在于：所述淡水发光细菌为青海弧菌。

3.根据权利要求2所述的一种利用淡水发光细菌检测铜污染土壤急性毒性的方法，其特征在于：所述青海弧菌为青海弧菌Q67。

4.根据权利要求3所述的一种利用淡水发光细菌检测铜污染土壤急性毒性的方法，其特征在于：所述第一步具体操作为：将4℃保存的青海弧菌Q67斜面菌种转接到新鲜斜面上，22℃培养24小时；将新鲜斜面的菌种接种到50ml液体培养基中，22℃振荡培养16～18小时；于4000rpm离心5min，弃去液体培养基，收集菌体；用10ml土壤背景溶液分别清洗菌体2次，每次于4000rpm离心5min，加入土壤背景溶液制成菌悬液，将发光值控制在10⁷RLU/s。

5.根据权利要求1至3任一项所述的一种利用淡水发光细菌检测铜污染土壤急性毒性的方法，其特征在于：所述第二步具体操作为：将玻璃纤维置于20ml注射器的底部，使注射器底部的小孔被0.5cm厚的玻璃纤维盖住；在注射器中加入30g待测土壤；在注射器中加入去离子水，使土壤含水量达到50cm张力下的土壤含水量，称重并记录重量；在20℃培养箱中放置24小时，使水分移动到土壤底部，检查注射器的重量 是否减少，如果减少再加入相应的去离子水；将一个用电线导管制成的PVC环放入50ml离心管，将注射器放入离心管中，使注射器的口和离心管的底部分开；在4000rpm离心45分钟，用10ml注射器将离心管中土壤溶液收集，0.45μm过滤于5ml塑料管。

6.根据权利要求1至3任一项所述的一种利用淡水发光细菌检测铜污染土壤急性毒性的方法，其特征在于：所述第三步包括以下具体操步骤：

1)、用加液枪取900μl土壤孔隙水加入发光仪样品管中；

2)、在样品管中加入100μl Q67细胞悬液，用加液枪混匀；

3)、让样品反应15分钟，在22℃下用发光仪检测发光值。