[发明专利]一种系统置换的多重基因扩增技术

权利要求书

1.“一种系统置换的多重基因扩增技术”，其特征是将靶基因DNA/RNA置换成与靶种系不同源的报告基因序列，再扩增报告系统间接指示靶分子。

2.根据权利要求1所述的系统置换扩增技术，系统置换特征在于待测模板靶DNA/RNA通过预选特异性的短探针杂交区分成两小段相邻序列合成短模板区扩增引物，同时将一段与靶不同源的长报告基因分成左右部份分别加在短模板区扩增引物5’端前面。带报告基因的短模板区引物扩增短模板时就带上了长报告基因序列，再用报告序列引物扩增中间带探针的长报告基因，两步指数式扩增间接放大指示靶分子。

3.根据权利要求2所述的系统置换扩增技术，其特征在于一种至N种待测靶基因系统置换成带一至N种不同探针的与靶不同源的同一报告序列系统，同一报告序列PCR扩增、同时指示多重靶分子。

4.根据权利要求2所述的系统置换扩增技术，其特征在于一种至N种靶基因每种选取另外2、3……n段特异杂交区并相应置换成带一至N种不同探针的另外报告序列2、3……，一套工作时污染了就换一套轮换使用。

5.根据权利要求2所述的系统置换扩增技术，所述预选特异性的短探针杂交区指靶基因特异性的、最保守的短遗传序列，长度为30-100base。

6.根据权利要求5所述的系统置换扩增技术，所述预选特异性的短探针杂交区长度优选为40-60base。

7.根据权利要求2所述的系统置换扩增技术，所述与靶种系不同源的报告基因序列指与靶基因同源性最小的、非特异性杂交最少的核酸序列、人造修饰核酸。其长度为50-1000base。

8.根据权利要求7所述的系统置换扩增技术，所述与靶种系不同源的报告基因序列长度优选为100-500base。

9.根据权利要求2所述的系统置换扩增技术，所述两步指数式扩增指靶置换扩增和报告系统扩增分两步PCR反应，反应条件与常规PCR相同，也可两步合并。所述扩增采用的耐热聚合酶指Taq、Tth、pfu、Vent等耐热聚合酶。

10.根据权利要求9所述的系统置换扩增技术，所述两步指数式扩增合并是指两步的退火温度差10℃以上时，两步合并于单管反应。所述扩增采用的耐热聚合酶优选热启动聚合酶。

11.根据权利要求1所述的“一种系统置换的多重基因扩增技术”，一样适用于所有常规PCR应用领域，实时荧光PCR(Real-time PCR)检测，PCR产物生物芯片(Micro-Array，微阵列)分析，分子组化，分子病理原位PCR。

12.一种带靶探针的报告基因序列，其特征是指一对与靶不同源的报告序列末端与靶探针序列首端重组的单链核酸。使用化学合成、不对称PCR、M₁₃质粒、固相分离方法生产。一对该报告序列以一端探针引物与靶基因结合、延伸，置换为带靶探针的报告系统，报告系统再扩增间接指示靶分子。

13.根据权利要求12所述系统置换扩增的一种带靶探针的报告基因序列单链可以是修饰碱基、类似碱基组成的人造核酸序列，采用各种理化方法小规模制备和工业自动化生产。

14.所述系统置换的多重基因扩增试剂盒成份包括：样本核酸提取试剂，带探针报告序列核酸，10mM dNTPs，Taq、Tth聚合酶及其缓冲液，荧光染料、荧光探针，报告系统引物F/R，凝胶电泳试剂和Oligos杂交芯片。