[发明专利]一种炭疽芽孢杆菌芽孢的蛋白质悬浮芯片制备及定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)芽孢(endospore)蛋白质悬浮芯片的制备方法及其定量检测方法。

背景技术

炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)是引起人兽共患病-炭疽的病原菌，为革兰氏阳性可形成芽孢的需氧菌，芽孢可以通过呼吸道、消化道、皮肤接触感染人类，一般在接触后7天出现感染症状，以皮肤型炭疽最常见。吸入大量炭疽芽孢(大于8000个)可引起吸入型炭疽，也称肺炭疽。由于炭疽芽孢具有对外界环境极强的抵抗力，致污染可持续存在，在军事上一直被列为是头号生物战剂之一。在一些国家曾生产并作为武器储存，而今又成为恐怖袭击选用剂，对人类造成新的更大的威胁。炭疽芽孢杆菌的抗原包括菌体抗原和芽孢抗原。炭疽芽孢杆菌的生存、增殖不需特殊条件设备及环境，在土壤中就可增殖，人工大量培养及使之变为芽孢十分容易。由于芽孢独特的生物学性状和危害，对炭疽芽孢的快速定量检测意义重大。

出于公共卫生和国家安全的目的，研究和开发快速、定性、定量检测传染病病原体是所属技术领域中长期致力追求的目标。尤其对于炭疽菌来说，作为一种烈性传染病的病原体，能否实现定量检测至关重要。目前用于炭疽菌的实验室常规检测方法有细菌学检测方法、血清学检测方法及检测核酸的分子生物学方法。但是，细菌学检测方法、血清学检测方法(例如间接血凝方法)及核酸检测法等现有检测技术存在许多缺陷。对于细菌学检测法，细菌培养耗时较长，不适合对炭疽菌的快速检测。对于核酸检测法，尽管采用了PCR技术对炭疽菌进行检测和分析特异性高，不容易被污染，但是现有PCR技术的方法繁琐，特别是此类方法包括DNA/RNA的提取和复杂的操作步骤，而且不能用于非核酸物质如蛋白质的检测，因此核酸检测法具有局限性且不方便。新近发展的免疫学检测方法生物传感器技术，如光纤传感器、电化学传感器、上转换磷光生物传感器、纳米传感器等以抗体检测报道较多，抗原直接检测的报道较少。本发明选择炭疽芽孢作为产芽孢的细菌及其芽孢的代表建立蛋白质悬浮芯片检测模型。

悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片(liquid array，liquidchip)，是20世纪70年代美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。目前，该技术已广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分析等领域。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.5μm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应。反应后，利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通道。检测通道中设有两道激光，一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目；一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时，两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的微球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。悬浮芯片技术由于利用微球在溶液中反应，克服了片膜芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响，同时利用激光检测技术，大大提高了样品检测的准确性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重复性好等特点。

目前发展的悬浮芯片主要是基于实验室检测方法的建立和方法评价及优化，以缩短检测时间，降低方法的检测成本。但是悬浮芯片是否能够检测炭疽及其芽孢，是否适合从粉末、液体等样品中快速直接检测，其定量检测能力如何，尚缺乏模型和评价。

发明内容

本发明的目的是提供一种炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)芽孢的蛋白质悬浮芯片，同时还提供基于该芯片的炭疽芽孢杆菌芽孢的定量检测方法。

本发明技术方案如下：