[发明专利]金黄色葡萄球菌中的ssrA在金葡菌感染防治中的应用

说明书

发明领域：

本发明属于生物技术领域，涉及金葡菌中的一种tmRNA-ssrA的应用，具体而言，本发明涉及ssrA作为反义RNA，作用于金葡菌色素合成相关的关键基因，调控金葡菌的色素合成，从而影响金葡菌抗宿主免疫的能力，及其在金葡菌感染的防治领域的用途。

背景技术：

金黄色葡萄球菌(金葡菌，Staphylococcus aureus)是人类的一种重要病原菌，能够引起肺炎、心内膜炎、烧伤及战伤感染、败血症、中毒性休克等多种严重感染。更为严重的是，抗生素的滥用导致金葡菌耐药性不断增强，如1961年发现的对β-内酰胺类抗生素耐药的耐甲氧西林金葡菌(MRSA)，1997年发现的耐糖肽类抗生素的耐糖肽金葡菌(GISA)，2002年10月又发现了耐万古霉素的金葡菌(VRSA)。2007年10月，Klevens R M等报道了2005年美国MRSA的感染人数超过9万人，感染率为31.8/100,000，死亡率为6.3/100,000，死亡人数超过HIV感染的死亡人数。由于耐药性的问题，金葡菌感染所致脓毒血症的防治不仅是现代创伤外科和危重病医学面临的棘手难题，也是微生物学领域亟待研究解决的热点课题之一。

对于金葡菌所致感染的防治，传统的思路是通过抑菌、杀菌和疫苗接种，但是在已揭示金葡菌基因表达谱的今天，深入探索金葡菌致病机理及其调控因素可能创建一条新的有效抗感染途径。

金葡菌表面的金黄色是分类学的一个经典指标，其色素由一系列的类胡萝卜素类化合物组成，其中staphyloxanthin是其主要的组成成分。研究结果表明，金葡菌表面的色素与细菌的致病性明显相关[Chamberlain N R et al(1991)Infect Immun 59：4332-4337]。金葡菌表面的色素合成主要由CrtM和CrtN两种蛋白参与[Wieland B.C.et al(1994)J Bacteriol 176：7719-7726]。LiuGY等人构建了crtM的突变体菌株，通过突变体菌株和野生型菌株的比较发现，金葡菌表面的色素具有明显的抗氧化能力，而这种抗氧化能力可以使细菌抵抗中型粒细胞的杀伤作用，提高细菌本身的致病性[Liu G Y et al(2005)JExp Med 202：209-215]。rsbUVWsigB系统能够金葡菌色素的合成，BischoffM等人的研究结果表明转录起始因子SigB能够上调crtMN操纵子的表达，其突变体菌株的色素合成明显降低[Palma M et al.(2001)Infect Immun69：7858-7865，Bischoff M P et al.(2004)J Bacteriol 186：4085-4099]。

ssrA又称为tmRNA和10sa RNA，在细菌内高度保守，其主要的生物学功能是通过行使tRNA和mRNA的双重功能，在合成停滞或者中断的蛋白质末端延伸出一段多肽，完成翻译，释放核糖体。该肽段能够被蛋白酶识别，从而使修饰的蛋白被迅速降解[Karzai A et al.(2000)Nat Struct Biol 7：449-455]。SmpB(small protein B)是ssrA发挥其生物学功能的关键蛋白质[Karzai A W et al.(1999)EMBO J 18：3793-3799.]。

申请人在通过基因突变的方法来研究ssrA的生物学功能的过程中发现，虽然由于金葡菌8325-4中的rsbU基因突变，导致其表面色素受阻，但是ΔssrA突变体菌株颜色明显的加深，而ΔsmpB突变体菌株颜色与野生型相同。相对于野生型菌株，该突变体抗氧化能力明显增强，并且其抗人中性粒细胞杀伤的能力明显增强。通过序列分析，发现ssrA_132-147这一区段与crt的SD序列互补，而凝胶阻滞实验证实ssrA_132-147和crtMN的5`UTR之间的存在相互作用，说明ssrA可能影响crtMN的翻译。

前面的实验表明SmpB不参与ssrA对色素合成的调控作用，申请人尝试寻找是否有其它蛋白参与。而构建的RNA伴侣分子Hfq蛋白的突变体菌株颜色也明显的加深，表明Hfq蛋白参与调控色素合成，而细菌色素光谱分析结果显示ΔssrA和Δhfq两株突变体表型相同。同样，Δhfq突变体抗氧化能力和在人中性粒细胞中的存活能力均明显增强。而免疫共沉淀结果表明，ssrA与crtMN的5`UTR之间的相互作用必需Hfq蛋白参与。