[发明专利]磷酸化和/或糖基化蛋白质或多肽的一步富集修饰测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及磷酸化和/或糖基化蛋白质及多肽的分离富集方法和位点测定。

背景技术

磷酸化是最常见的蛋白质共价修饰，在三分之一的真核基因表达产物中都存在这种修饰。它调节着基本的细胞行为：细胞分裂，生长，分化。由于用基因序列无法预知磷酸化和其他翻译后修饰，研究者们就发展了一些其他的方法。

传统的测定磷酸化位点的方法一般包括：在菌种培养生长基中对磷酸化位点的放射性标记术，然后用免疫沉淀法或者SDS-PAGE法，经酶消化，进行Edman降解分离含有32P同位素标记的蛋白。这种方法，除了对操作员健康的潜在危害以外，磷肽低丰度也降低了敏感性，和放射性标签的无效结合，自动edman测序的低灵敏度限制了大量生物样品的应用。

质谱，一直被用来鉴定蛋白质，现在被认为是表征翻译后修饰蛋白质的最好技术。这种方法快速、灵敏而且不需要放射性标签。两种软电离技术——机制辅助激光解析电离质谱和电喷雾质谱，已经被成功的应用于蛋白质磷酸化位点的检测。但是，由于以下原因，用质谱进行常规的磷酸化蛋白质表征的广泛应用仍然存在制约。

第一、由于磷酸基团自身带有负电荷抑制了离子化效率，在质谱的正离子模式下，特征峰的强度很低，难以被检测到。

第二、蛋白质混合中，相对于非磷酸化多肽，磷酸化多肽化学含量非常低，使得混合物中磷酸化多肽全部表征变得困难。

第三、磷酸肽的亲水特性也许会导致在RP-HPLC中被洗掉。

第四、难以对特异的大的磷酸化蛋白水解片段进行全面的测序。

因此，设计一种方法，通过在蛋白质或多肽的翻译后修饰位点上添加捕获标签，并通过高效化学反应进行富集，并在专一的切割过程中产生质谱质量标签以及质谱信号增益标签的话，即能达到快速高效富集修饰蛋白质或多肽以提高翻译后修饰位点测定效率的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种磷酸化和/或糖基化蛋白质或多肽的一步富集修饰测定方法。

本发明提供的磷酸化和/或糖基化蛋白质或多肽的富集修饰测定方法，包括如下步骤：

1)蛋白质或多肽的端炔基或叠氮基修饰：

将目标底物与饱和氢氧化钡水溶液、端炔基标签化合物的乙醇溶液混合，温育后得到端炔基修饰的目标底物；

其中，目标底物为磷酸化及糖基化蛋白质或多肽，具体可为磷酸化丝氨酸、氧连接糖基化丝氨酸、磷酸化苏氨酸或氧连接糖基化苏氨酸残基；

2)端炔基修饰的蛋白质或多肽的树脂捕获：

在上述端炔基修饰的目标底物中加入叠氮基修饰的聚苯乙烯树脂，并加入抗坏血酸和硫酸铜的混合物或碘化亚铜，以点击化学反应将端炔基修饰的目标底物捕获到该叠氮基修饰的聚苯乙烯树脂上；

3)树脂上端炔修饰多肽/蛋白的切割：

将叠氮基修饰的聚苯乙烯树脂上连接的端炔基修饰的目标底物分子切割下来，同时在端炔基修饰的目标底物分子末端自动形成一个质谱信号增益标签，之后利用质谱完成磷酸化和/或糖基化蛋白质或多肽的测定。

该方法的步骤1)中，端炔基标签化合物的结构通式如式I所示，

式I结构通式中，R₀为R-X-、笏基保护氨基端半胱氨酸酯基或笏基保护氨基端赖氨酸酯基；

其中，R-X-中，R为SH-或-NH₂，X为主链碳原子个数为1～6、总碳原子个数为1～10的烷基链或含有酯基或酰胺基的主链碳原子个数为2～8、总碳原子个数为2～12的烷基链。

当X为含酯基或酰胺基的烷基链的标签化合物时，制备上述端炔基标签化合物的方法，包括如下步骤：

1)将巯基羧酸或半胱氨酸进行巯基保护反应；

2)将所述步骤1)得到的产物进行酯化或酰胺化反应；

3)将所述步骤2)得到的产物进行巯基的脱保护反应，得到所述端炔基标签化合物。

该方法中，所述步骤1)中，巯基保护反应是按照下述a-d中的任意一种方法进行的：

a、将巯基羧酸或半胱氨酸与S，S-二苯基-S-甲氧基硫腈于有机溶剂中进行反应；

所述巯基羧酸或半胱氨酸与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为1∶2；反应时间为30℃，反应时间为4小时；

b、将巯基羧酸或半胱氨酸溶于乙醇和氨水的混合液中，加入苄氯进行反应；

所述巯基羧酸或半胱氨酸与苄氯的摩尔比为1∶1-2，优选1∶1.2；反应时间为30分钟，反应温度为25℃；所述乙醇和氨水的混合液中，乙醇和氨水的体积比为3∶1-3；