[发明专利]一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及核酸固相有机载体及其制备方法，更具体的说，是涉及一种通用型聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体及其制备方法。

背景技术

核酸固相有机合成是将固相合成和亚磷酰胺法相结合，借助于商品化的DNA/RNA合成仪(如ABI公司的392DNA/RNA合成仪或GE公司的KTA oligopilot DNA/RNA合成仪)，在固相载体上依次按照核酸序列进行偶联，实现快速、高效、稳定的核酸合成。由于固相有机合成具有自动化程度高、产物量大、没有序列限制、合成产物易进行化学修饰等优点，因此是目前获得大量核酸最主要的途径之一。

目前大多数核酸固相载体均是在可控孔度玻璃(CPG)载体上连接目标核酸的起始核苷单体，以此提供核酸序列衍生的活性位点，在此基础上依次进行目标序列的合成，如Sigma公司的核酸合成系列载体就是将CPG与核苷单体通过琥珀酸键连接得到的，CPG上核苷单体作为合成核酸序列的起始核苷。除琥珀酸键外，还有一些化学间臂也能用于连接CPG和起始核苷单体，如Alul和Pon分别采用乙二酰键和对苯二酚-O，O’-乙酰乙酸键作为连接间臂，得到了不同的CPG固相有机合成载体(Alul，Nucleic Acids Research(19)：1527(1991)；Pon，NucleicAcids Research(25)：3629-3635(1997))。

CPG作为一种无机硅氧基载体，具有表面易衍生、反应活性较高、不溶胀等优点，但由于其表面富含羟基，亲水性较强，且其保护基在合成过程中易脱落，一定程度上影响了核酸的合成效率和质量。此外，传统的固相载体根据连接的起始核苷(A、T、C、G、U)分为不同的种类，要满足不同序列的合成要求需备齐全部种类的固相载体，提高了试验成本和工作量。

聚苯乙烯(PS)是一种性能优异的有机载体，McCollum C等利用甲基聚苯乙烯偶联核苷单体琥珀酸衍生物作为固相有机合成载体进行DNA的合成，取得了较好的合成效果(McCollum，Tetrahedron Letters 32：4069-4072(1991))。聚苯乙烯表面疏水，通过无水溶剂的淋洗能够彻底除去表面的残留水分，减少水分对核酸合成的干扰，其表面经过氨基衍生后活性位点相对较少，核酸合成过程中不易产生错误序列，产物纯度较高。针对传统载体需分类的问题，Lyttle等开发了一类以CPG为基质的通用载体，它仅提供核酸合成的位点(活性羟基)而不连接起始核苷，能够满足不同核酸序列合成，解决了固相载体分类的麻烦(Lyllle，Nucleic Acids Research24：2793-2798(1996))。Nelson等也开发了一种名为“Rainbow^TM”的通用CPG载体，合成性能也相当优异(Nelson，BioTechniques 22：752-759(1997))。

本发明将氨甲基聚苯乙烯与3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，2-丙二醇通过琥珀酸键连接，制备了一种通用型的聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种核酸固相有机合成载体。

本发明的目的还在于提供一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体，它载量高于传统载体，能够满足各种核酸序列的合成需要，具有较好的合成性能。

本发明的目的还在于提供一种核酸固相有机合成载体的制备方法。

本发明的目的还在于提供一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法。

本发明提供的聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体，它是将氨甲基衍生的聚苯乙烯载体通过琥珀酸键与3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，2-丙二醇偶联得到的固相载体。载体的载量大于60μmol/g载体，合成反应中每步偶联效率大于95％。同时，它具有通用性，能够满足各种核酸序列的合成需要。

本发明还提供了一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法，包括以下步骤：

(a)在浓度为0.1～5.0mmol/g载体的催化剂存在条件下，聚苯乙烯载体与N-氯甲基邻苯二甲酰亚胺在有机溶液中反应，得到邻苯二甲酰亚胺甲基聚苯乙烯载体；

(b)邻苯二甲酰亚胺甲基聚苯乙烯载体在浓度为3～30％肼的乙醇溶液中反应，得到氨甲基聚苯乙烯载体；

(c)氨甲基聚苯乙烯载体与琥珀酸酐在有机溶液中于室温反应，得到琥珀酰胺甲基聚苯乙烯载体；