[发明专利]可逆地控制细胞在金层表面的自组装单层膜上黏附的方法

权利要求书

1.一种可逆地控制细胞在金层表面的自组装单层膜上黏附的方法，其步骤为：先制备可共价连接于金层表面的由化合物1与化合物2均匀混合形成的第二自组装单层膜，再将经培养的细胞黏附于所述金层表面的第二自组装单层膜上；

所述化合物1的分子式为：

所述化合物2分子式为：

通过紫外光和可见光对金层表面的第二自组装单层膜照射的切换，实现细胞在所述金层表面的第二自组装单层膜上的可逆控制；其可逆控制如下：

用浓度为1mg/mL甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸的水溶液浸泡所述金层30分钟～1小时，黏附于所述金层表面的第二自组装单层膜上的细胞从所述第二自组装单层膜上完全脱附；所述甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸简称为GRGDS；

用340-380nm的紫外光照射该金层表面的第二自组装单层膜5～12小时，所述第二自组装单层膜中的化合物1的偶氮苯的构象由反式变为顺式，所述化合物1的偶氮苯末端的GRGDS肽埋没在所述化合物2中，所述金层表面的第二自组装单层膜变为惰性，在该变为惰性的第二自组装单层膜上培养细胞，只有少许细胞在该变为惰性的第二自组装单层膜上黏附；

用浓度为1mg/mL GRGDS的水溶液浸泡所述金层30分钟～1小时，黏附于所述第二自组装单层膜上的少许细胞完全脱附；

再用450-490nm的可见光照射所述金层表面的第二自组装单层膜20分钟～1小时，金层表面的第二自组装单层膜中的化合物1的偶氮苯的构象由顺式变为反式，埋没在所述化合物2中的GRGDS又伸展到所述第二自组装单层膜的末端，在该金层表面的第二自组装单层膜上培养细胞，细胞又黏附到该金层表面的第二自组装单层膜上。

2.按权利要求1所述的可逆地控制细胞在金层表面的第二自组装单层膜上黏附的方法，其特征在于，所述的化合物2的合成步骤如下：

反应起始物11-巯基十一烷酸的巯基与三苯基氯甲烷以摩尔比1∶1.1反应，该反应在甲苯溶剂中进行，反应过程中加入N，N-二异丙基乙胺作为催化剂，生成化合物4；所述N，N-二异丙基乙胺的加入量为所述三苯基氯甲烷的两倍；所生成的化合物4的结构式为：

将化合物4与六聚乙二醇进行酯化进行反应，六聚乙二醇用量为化合物4的16.7倍，化合物4选择性地连接六聚乙二醇的一端，生成化合物10，所生成的化合物10的结构式为：

在含5％(v/v)三氟乙酸的二氯甲烷溶液的脱保护下，以三乙基硅烷作俘获剂，脱去化合物10的三苯甲基，得到化合物2；所述三乙基硅烷与化合物10的摩尔比为5∶1；

所述的化合物1的合成步骤如下：

先合成目标化合物3：

反应起始物11-巯基十一烷酸的巯基与三苯基氯甲烷以摩尔比1∶1.1反应，该反应在甲苯溶剂中进行，反应过程中加入N，N-二异丙基乙胺作为催化剂，生成化合物4；所述N，N-二异丙基乙胺的加入量为所述三苯基氯甲烷的两倍；所生成的化合物4的结构式为：

将化合物4与N-羟基琥珀酰亚胺按1∶1.2的摩尔比反应，生成化合物(活化酯)5，所述化合物5的结构式为：

将化合物5以每10秒滴一滴的速率加到2，2-(1，2-二氧乙基)双二乙胺的二氯甲烷溶液中，化合物5选择性地与2，2-(1，2-二氧乙基)双二乙胺一端的氨基反应，得到化合物6；所述化合物5与2，2-(1，2-二氧乙基)双二乙胺摩尔比为1∶17；所述化合物6的结构式为：

对硝基苯甲酸在5wt％的氢氧化钠溶液中反应，生成化合物7，所述化合物7为4，4’-羧基偶氮苯，其结构式为：

将化合物7与N-羟基琥珀酰亚胺以摩尔比1∶2.4进行反应，化合物7两端的羧基被N-羟基琥珀酰亚胺活化，生成化合物8，所述化合物8结构式为：

将化合物8溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，加热60℃使之完全溶解；将化合物6以每10秒滴一滴的速率滴加到化合物8的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，化合物6选择性地与化合物8一端的活化酯反应，反应6小时生成化合物9；所述化合物6与化合物8的摩尔比为1∶15；所述化合物9的结构式为：

在含5％(v/v)三氟乙酸的二氯甲烷溶液脱保护下，以三乙基硅烷作俘获剂，脱去化合物9的三苯甲基，得到化合物3；所述三乙基硅烷与化合物9的摩尔比为5∶1；所述化合物3的结构式为：

将玻璃片基底清洗干净，吹干；在该玻璃片基底的表面上先蒸镀2～10nm厚的钛黏附层，然后再在钛黏附层上蒸镀20～50nm厚的金层；

将所得化合物3配制成1mM～10mM的乙醇溶液，在氮气保护下，用可见光照射该溶液3～5小时，再在黑暗的环境中室温下放置3～7天，确保化合物3的偶氮苯的构型全部变为反式；

将所得化合物2溶解于的无水乙醇中，使其摩尔浓度为1mM～10mM；

将所述的偶氮苯构型全部变为反式的化合物3的乙醇溶液与所述化合物2的乙醇溶液均匀混合成混合溶液，混合溶液中的偶氮苯构型全部变为反式的化合物3与化合物2的摩尔比为1∶100～1∶10000；所述混合溶液的总摩尔浓度为2mM；

将上述蒸镀有金层的玻璃片基底置入所述混合溶液中浸泡4～12小时，取出玻璃片基底，用无水乙醇洗3遍，再用氮气吹干，得到附着于所述玻璃片基底的金层上的由所述化合物2与所述偶氮苯构型全部变为反式的化合物3均匀混合而形成的第一自组装单层膜；

将GRGDS连接到所述第一自组装单层膜中的构型全部变为反式的化合物3的偶氮苯末端：

将GRGDS肽溶解于pH 8.0的磷酸缓冲液中，使其浓度为2mg/mL，将上述共价连接了第一自组装单层膜的玻璃片基底置入该磷酸缓冲液中，反应5～20分钟，GRGDS上甘氨酸的伯胺基与第一自组装单层膜上的、构型全部变为反式的化合物3的偶氮苯末端的活化酯反应，通过化学键共价连接到所述第一自组装单层膜上的、构型全部变为反式的化合物3的偶氮苯的末端，得到化合物1。

3.按权利要求1或2所述的可逆地控制细胞在金层表面的第二自组装单层膜上黏附的方法，其特征在于，所述第二自组装单层膜的制备如下：

配制pH 7.4的PBS缓冲液、pH 8.0的磷酸缓冲液和pH 8.6的磷酸缓冲液；

将GRGDS肽溶解于所述pH 8.0的磷酸缓冲液中，制得含GRGDS的磷酸缓冲液，所述GRGDS肽在GRGDS的磷酸缓冲液的浓度为1mg/mL；

将所述共价连接了第一自组装单层膜的金层置入所述GRGDS的磷酸缓冲液中，反应20分钟，GRGDS上的甘氨酸的伯胺基与所述金层表面的第一自组装单层膜中的化合物3的末端的活化酯反应，通过化学键共价连接到所述金层表面的第一自组装单层膜中的化合物3的末端；

取出金层，先用PBS缓冲液洗3遍，再用pH8.6的磷酸缓冲液洗3遍，随后再用PBS缓冲液洗3遍，再用水和无水乙醇各冲洗3遍，最后用惰性气体把金层吹干，得到共价连接于金层表面的由化合物1与化合物2均匀混合形成的第二自组装单层膜。