[发明专利]人工合成用于转基因抗虫植物的Bt杀虫基因

说明书

技术领域：

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及用于植物表达的Bt Cry1Ac-M基因。

背景技术：

Bt基因编码杀虫晶体蛋白，来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，该菌为革兰氏阳性土壤杆菌，属于芽孢杆菌属，其菌体为短杆状，生鞭毛，单生或形成短链。它在芽孢形成过程中产生称为δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白(控制合成这种蛋白质的基因在质粒上)，这些蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等多种昆虫具有特异性的杀虫活性。

1981年Schenpf和Whiteley从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中克隆了第一个编码δ-内毒素的cry基因Cry1Aa1。1985年Adang，M.J等从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中克隆了Cry1Ac基因，但由于该基因序列特征使得其在过去的二十几年中一直没有得到实际应用。截止到目前，已确定数十种苏云金芽孢杆菌菌系及130多种它们编码的杀虫晶体蛋白。

1983年美国华盛顿大学宣布成功将卡那霉素抗性基因导入烟草细胞，以及同年4月美国威斯康星大学宣布成功将大豆基因转入向日葵共同标志着植物转基因技术的诞生。1986年，首批转基因植物(抗虫、抗除草剂)被批准进入田间试验。1989年哺乳动物抗体重链和轻链基因在烟草中成功表达并正确组装成有功能的抗体。1990年Gordon-Kamm首次报道用基因枪转化玉米悬浮细胞系获得了可育的转化体。随后，玉米转基因技术开始迅猛发展，大量转基因植物陆续研制开发成功。Koziel(1993)等培育出了抗虫转基因玉米，转基因植株能高水平表达CryIA(b)抗虫基因。张秀君(1999)等用基因枪法将两个含高赖氨酸蛋白质基因导入玉米的胚性愈伤组织。刘大文(2000)等将Zm13-Barnase基因转化玉米胚性愈伤组织，经过除草剂筛选得到阳性植株。Ishida(1996)等首次利用超双元载体建立了根癌农杆菌转化玉米自交系的幼胚，Frame(2002)等成功实现了根癌农杆菌利用普通的双元载体转化幼胚。张艳贞(2002)等对根癌农杆菌介导法将Bt杀虫基因导入优良玉米自交系进行了较为系统的研究。Huang和Wei(2005)利用根癌农杆菌成功转化了常规玉米自交系。Frame(2006)等和Lee(2007)等分别利用农杆菌成功转化了常规玉米自交系。

我国在转基因技术研究方面，已经建立了比较成熟的玉米转基因技术体系，在国内，中国农业大学较早的开展了玉米遗传转化的工作，1994在国内外首次用子房注射的方法把抗虫基因Bt转入玉米并获得转基因植株，以自主知识产权基因Bt为代表的抗虫玉米已展示了良好的开发前景。同时，在无选择标记、选择标记基因删除和目标基因产物定时降解、植物组织特异性优势表达等核心技术创新方面已具有较强的创新能力。目前已分离的抗虫基因很多，主要的抗虫基因有：①细菌来源的抗虫基因，主要是Bt毒蛋白基因(Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2、Cry3等)；②植物来源的蛋白酶抑制剂基因，特点在于抗虫谱广、来源于植物本身易于被公众接受；③细菌来源的营养杀虫蛋白(Vip1、Vip2、Vip3等)，广谱抗鳞翅目，特别是对小地老虎、粘虫和甜菜叶蛾具有较强作用。由于基因抗虫能力及昆虫耐受性的影响，转基因抗虫产品主要通过获得更多更有效的抗虫基因、改造已有基因、双抗植物体等途径获得。

美国是世界上种植转基因玉米最大的国家，转基因玉米推广面积占美国玉米总面积的比例由2000年的25％上升至2007年的73％。数据显示，由于Bt玉米的使用，农药和杀虫剂的用量明显下降，大大减少了对环境的污染。既减少了农业生产成本，又可以节省劳动力。玉米抗虫的优良性状为社会带来了巨大的经济和环境效益，并被越来越多的大众所接受，其推广面积逐年大幅度提高。

本实验室对Cry1Ac基因进行了基因编码框长度及密码子优化改造，Cry1Ac对鳞翅目昆虫(如玉米螟)有很强的毒性，但是原始的基因不能在植物中高效表达，达不到植物保护的要求，我们按照单子叶植物编码特征对Cry1Ac基因进行了全面的改造，改造后的Cry1Ac-M被连在CaMV35S-Adh1为启动子的表达载体上。通过共转化的方法，把Bt基因Cry1Ac-M转到具有高效转化效率的玉米自交系中，然后通过回交的方法获得了含有抗虫基因Bt Cry1Ac-M的转基因玉米骨干自交系。

发明内容：

发明目的