[发明专利]双拷贝β-甘露聚糖酶的基因工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及双拷贝β-甘露聚糖酶的基因工程菌及其应用。 

背景技术

甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，由β-1，4-D吡喃甘露糖连接而成的线状多糖。甘露聚糖具有高亲水性，在单胃动物的消化道内大量吸水，增加了消化道内容物的粘度，抵抗胃肠的蠕动，直接影响动物对营养物质的消化和吸收。近年来，随着豆类产品(豆粕等)在动物饲粮中的广泛应用，甘露聚糖的抗营养作用也越来越受到重视。2005年，我国大豆产量1800万吨，进口量为2300万吨，其中，80％以上用于饲料。豆粕中甘露聚糖的含量在2％以上。其降解主要依靠添加β-甘露聚糖酶。近年来，随着豆类产品(豆粕等)在饲粮中的广泛应用，甘露聚糖的抗营养问题也越来越受到重视，在饲料中添加酶制剂是解决这一问题的主要途径。甘露聚糖的完全酶解需要β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶和脱乙酰酶的协同作用，其中β-甘露聚糖酶在饲料中的应用比较广泛。β-甘露聚糖酶是一类能水解甘露聚糖的半纤维素酶类，广泛存在于动植物和微生物中。有报道，在大猪饲料中添加β-甘露聚糖酶，可以提高平均日增重10％以上；在肉鸡饲料中添加β-甘露聚糖酶可以提高饲料的转化率4％～6％，提高鸡的抗病力，改善肉用鸡的健康状况。 

发明内容

本发明的目的是提供一种双拷贝β-甘露聚糖酶的基因工程菌及其应用。 

本发明所提供的双拷贝β-甘露聚糖酶的基因工程菌，命名为GS115-PIC-MANM，是将两个拷贝的β-甘露聚糖酶基因导入酵母菌中获得的重组菌。 

其中，所述β-甘露聚糖酶基因的核苷酸序列为GenBank DQ464114。所述酵母菌为毕赤酵母GS115。 

巴氏毕赤酵母(pichia pastoris)GS115-PIC-MANM已于2009年04月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.3031。 

本发明的另一个目的是提供一种生产β-甘露聚糖酶的方法。 

本发明所提供的生产β-甘露聚糖酶的方法，是用所述的重组菌发酵生产β-甘露聚糖酶。 

其中，所述的发酵培养基可为任何适合酵母生长的培养基，如BMGY培养基。 

所述发酵过程中溶解氧饱和度第一次为100％时，流加25％(质量百分含量)甘油。所述发酵过程中溶解氧饱和度第二次为100％时，流加甘油与甲醇的混合物。所述发酵过程中溶解氧饱和度为30％以上流加甘油与甲醇混合物；所述发酵过程中溶解氧饱和度为30％以下，流加甘油。所述甘油与甲醇的混合物中，甘油与甲醇的的质量比为(6-9)∶1。 

本发明的方法生产的β-甘露聚糖酶具有比活性高、酸稳定性好、催化pH值范围广等优点，适于用作猪、鸡等单胃动物的添加剂。 

附图说明

图1为PCR扩增β-甘露聚糖酶基因。 

图2为10L发酵罐中GS115-PIC-MANM经甲醇诱导不同时间表达的β-甘露聚糖酶SDS-PAGE电泳。 

图3为10L发酵罐中菌体浓度和β-甘露聚糖酶活性变化。 

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。 

实施例1、GS115-PIC-MANM生产β-甘露聚糖酶 

一、表达β-甘露聚糖酶的GS115-PIC-MANM的构建 

1、硫色曲霉的药配及其总RNA的提取