[发明专利]表达非淀粉多糖复合酶的重组巴氏毕赤酵母菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达非淀粉多糖复合酶的重组菌及其应用，特别涉及一种表达非淀粉多糖复合酶的重组巴氏毕赤酵母菌及其应用。

背景技术

非淀粉多糖(NSP)是植物组织中由多种单糖和糖醛酸经糖苷键连接而成的，大多有分支的链状结构，常与无机离子和蛋白质结合在一起，是细胞壁的主要成分，一般难于被单胃动物自身分泌的消化酶所分解。

许多研究成果表明，饲料中添加NSP酶制剂，通过对饲料中抗营养因子-NSP的水解，可以降低动物胃肠道食糜黏度，消除其抗营养作用，改善饲料营养价值，提高动物生产性能。因此为了高效地、最大限度地消除日粮中NSP的抗营养作用，提高饲料消化利用率，在饲料中添加应用NSP复合酶就显得十分重要，与此同时还可以充分发挥不同NSP酶系在底物降解上的协同效应，提高饲用酶制剂的生物学效价。

当前饲用非淀粉多糖复合酶制剂的生产方式主要有以下三种：

①完全复配法：指生产或购买各种单一酶制剂，按照酶谱配方比例进行合理配比，再加入一定的分散剂、稀释剂并经混合而成。这是饲用复合酶早期生产普遍采用的方法。完全复配法要求各单一酶制剂的质量均可靠，同时各单酶复配时应严格按照酶谱配方来执行。该方法缺点较多，如基础数据的缺乏使得饲用复合酶酶谱配方的合理设计较为困难，各种商品纯酶制剂的高成本使得复配后饲用复合酶的成本较高；此外，完全复配法所生产的饲用复合酶很难获得除酶功能以外的可促进动物生长的一些未知生长因子等。

②单菌株发酵法：在自然界中筛选能够同时分泌表达多种非淀粉多糖酶的菌株，并利用各种诱变的方法获得符合配方要求的优良高产菌株，经发酵制取所得的粗酶即为复合酶制剂。然而大多数菌株在分泌酶时会根据培养基中底物的组成而进行有选择性的分泌酶，故利用该法获得的复合酶制剂实质上仅以一种或两种酶制剂为主，而其它相应酶制剂的分泌量较少且活性很低。目前工业用复合酶的来源主要是好氧丝状真菌木霉属和曲霉属，木霉菌发酵产物中存在多种真菌毒素，有毒性嫌疑，且丝状真菌发酵较难控制，菌种易退化。

③多菌株混合发酵：将各个菌株混合接种，一次发酵形成符合配方要求的复合酶制剂产品。该法理论上可行，但实际生产操作过程中因不同菌种发酵产酶的条件及需求各异，彼此间相互拮抗，故该技术应用难度很大。

发明内容

本发明的目的在于提供表达非淀粉多糖复合酶的重组巴氏毕赤酵母菌及其应用。

本发明的重组菌，是含有木聚糖酶基因、纤维素酶基因和β-甘露聚糖酶基因的重组巴氏毕赤酵母菌。

上述木聚糖酶基因的编码序列是自Genbank号为AJ292317的5′端第1-576位的核苷酸序列；上述纤维素酶基因的核苷酸序列是自Genbank号为EU022559的5′端第88-1500位的核苷酸序列；上述β-甘露聚糖酶基因的核苷酸序列是自Genbank号为AY623903的5′端第122-1051位的核苷酸序列。

其中，所述木聚糖酶基因通过重组表达载体a导入所述巴氏毕赤酵母菌中，构成重组巴氏毕赤酵母菌A，该重组表达载体a是将所述木聚糖酶基因插入到表达载体pPIC9中得到的表达木聚糖酶的重组表达载体。

所述纤维素酶基因通过重组表达载体b导入所述重组巴氏毕赤酵母菌中A，构成重组巴氏毕赤酵母菌B，该重组表达载体b是将所述纤维素酶基因插入到表达载体pPIC9K中得到的表达纤维素酶的重组表达载体。

所述β-甘露聚糖酶基因通过重组表达载体c导入所述重组巴氏毕赤酵母菌B中得到本发明的重组菌；所述重组表达载体c是将所述β-甘露聚糖酶基因连接到表达载体pPICZαA上得到的表达β-甘露聚糖酶的重组表达载体。

所述巴氏毕赤酵母菌为巴氏毕赤酵母菌(Pichia pastoris)GS115。

上述重组菌为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-NSP，已于2009年04月16日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC №.3025。

本发明的另一目的在于提供所述的重组菌在生产非淀粉多糖复合酶中的应用。

所述应用是将本发明的重组菌，在温度28-30℃，pH5.0-6.0，溶氧为30％-60％，进行诱导发酵，表达出非淀粉多糖复合酶。